从安大略省土壤中分离与普通菜豆(Phaseolus vulgaris)高效固氮的根瘤菌(Rhizobium)

《Applied and Environmental Microbiology》：Isolation of rhizobia from Ontario soils that are effective at fixing nitrogen with common bean (Phaseolus vulgaris)

　　

普通菜豆(Phaseolus vulgaris)在加拿大乃至全球范围内都是重要作物。与其他豆科植物一样，普通菜豆能与称为根瘤菌(rhizobia)的固氮细菌建立共生关系。然而，根瘤菌与普通菜豆共生时的固氮作用往往欠佳，制约了其生产力，并迫使种植者施用氮肥。为了支持为安大略省普通菜豆种植者开发高性能、适应当地条件的根瘤菌接种剂，研究人员采用结瘤诱捕(nodule trapping)方法，利用4个普通菜豆品种从安大略省南部土壤中分离获得216株可结瘤的根瘤菌。对所有根瘤菌分离株进行全基因组测序(whole genome sequencing)及随后的系统发育基因组学(phylogenomics)分析，揭示了显著的多样性，将其划分为11个根瘤菌属(Rhizobium)物种，其中包括2个新物种。几乎所有分离株都属于菜豆共生变种(symbiovar phaseoli)，覆盖nodC γ-a、γ-b和α等位基因，另有4株属于gallica共生变种(symbiovar gallica)。土壤来源对结瘤诱捕实验中恢复的物种水平群落组成具有显著影响；相比之下，诱捕用宿主品种对恢复的根瘤菌种群影响较小。温室试验表明，其中一个新根瘤菌物种表现出最高的平均共生有效性，但多个物种中也存在高质量分离株。综上所述，这些结果揭示了安大略省南部土壤中存在一个多样且基因组可变的根瘤菌群落，能够与普通菜豆形成有效共生。重要的是，本研究的基因组测序根瘤菌菌株资源库将作为鉴定具有竞争力和高质量菌株的宝贵资源，用于开发针对安大略省普通菜豆生产的接种剂。

普通菜豆(Phaseolus vulgaris)是全球重要的食用豆类，在加拿大尤其安大略省等地种植广泛，但该作物与根瘤菌的共生固氮效率常不理想，导致种植者大量依赖化学氮肥。为开发适应当地农业气候条件的高效根瘤菌接种剂，研究人员从安大略省南部6个地点采集13份土壤（合并为9份样品），利用4个普通菜豆品种进行结瘤诱捕，共分离获得216株可结瘤的根瘤菌。通过全基因组测序和系统发育基因组学分析，这些菌株被归入11个根瘤菌属(Rhizobium)物种，其中两个为未命名新种。温室共生效率试验发现，一个未命名新种(Rhizobium sp. A)平均能使菜豆获得最高的植株干重，但多个物种中均存在高效菌株。研究还发现土壤来源显著影响根瘤菌群落组成，而宿主品种影响较弱。这些结果表明，安大略省南部土壤中存在多样且具有基因组可塑性的根瘤菌群落，已具备开发高效接种剂的潜力，为后续筛选竞争性强、高质量的菌株奠定了资源基础。

研究采用的关键技术方法包括：结瘤诱捕法（以4个菜豆品种分别接种9份土壤悬液，收集粉红色大根瘤，表面消毒后涂板分离纯化根瘤菌）；全基因组测序与组装（利用Oxford Nanopore Technologies平台测序，Flye和Medaka组装，获得136个闭合基因组和80个高质量草稿基因组）；物种分类与系统发育分析（使用GTDB-Tk初步分类，FastANI与型菌株比对确定物种归属，对去重复后的37株代表菌株构建核心蛋白质组最大似然树）；共生变种鉴定（基于nodC基因系统发育及HMM识别等位基因）；温室表型筛选（测定归一化差异植被指数NDVI和地上部干重）；氮肥与接种互作试验（在持续或一次性施氮条件下比较接种与否的植株生物量）。样本队列来源为安大略省Huron Research Station、Elgin商业农场、Kingston社区/家庭花园、Caledon家庭花园和Brampton前家庭花园的土壤。

### 安大略省土壤拥有多样的可与普通菜豆结瘤的根瘤菌群落

通过结瘤诱捕和全基因组分析，216株菌分为11个Rhizobium物种，其中两个为新种。基因组大小在6.3–7.8 Mb之间，携带4–8个复制子。泛基因组分析显示共有20528个基因家族，其中核心/软核心基因组占21%，各物种具有数量不等的特有基因。

### symbiovar phaseoli是优势共生变种

nodC系统发育显示，212株属于菜豆共生变种(symbiovar phaseoli)，4株R. mongolense属于gallica共生变种。在symbiovar phaseoli中，72%携带γ-a等位基因，13%携带γ-b，13%携带α。对23株代表菌株的nod基因组织分析发现5种组织类型，且同一Rhizobium物种可包含多个symbiovar phaseoli亚支，表明共生基因存在广泛水平转移。

### 土壤来源影响结瘤诱捕获得的根瘤菌多样性

对物种组成做PERMANOVA分析，土壤来源解释70%的方差(Pr(>F)=0.001)，而宿主品种影响不显著(Pr(>F)=0.48)。西南安大略土壤（长期种植菜豆）的根瘤菌群落以R. croatiense为主，与中南部/东南部土壤的群落明显不同。

### 安大略省土壤根瘤菌可与普通菜豆有效固氮

温室初筛中，与不施氮对照相比，绝大多数菌株提高了菜豆地上部干重。物种间存在显著差异；R. hidalgonense和R. laguerreae固氮能力较弱，而新种Rhizobium sp. A平均干重为2.3 g/株，比全部接种植物平均值（1.7 g/株）高约38%。后续对12株菌的重复验证试验基本支持上述结果。另外，第3周NDVI与最终地上部干重显著相关，说明早期结瘤固氮对最终产量有重要作用。

### 在实验室条件下，根瘤菌接种与有限氮肥具有协同作用

持续施氮试验中，低浓度氮（≤1 mM）下接种显著增加生物量，高浓度（10、20 mM）下接种无额外益处；一次性施氮试验中，接种在所有氮浓度下均有益，且添加量在0–5 mM范围内与接种效益呈正相关。这说明适量“启动氮”可促进根瘤菌结瘤固氮并有利于植物生长。

讨论总结：研究发现安大略省南部土壤中的菜豆根瘤菌物种多样性高，且土壤环境/种植历史比宿主品种更强地影响群落结构。新种Rhizobium sp. A具有较高的平均共生效率，但尚需更多品种和田间条件验证。此外，接种剂开发还需考虑菌株竞争结瘤能力、多环境下稳定性等，未来需进行多品种、多土壤的筛选和竞争试验。最终，基因组测序的菌株资源库为后续生态学、进化和应用研究奠定了基础。

翻译研究结论：研究表明，安大略省南部土壤中存在多种能够与普通菜豆有效固氮的根瘤菌，其中一个未命名新种(Rhizobium sp. A)平均共生效率最高。本研究建立的基因组测序根瘤菌菌株库为开发适应该地区的商业接种剂提供了宝贵资源，并为减少化学氮肥依赖、提高温带农业生态系统的可持续性奠定了基础。