利用糖基标记寡核苷酸进行跨靶标与细胞优先的CRISPR-Cas9抑制

《TRENDS IN Biotechnology》：Cross-target and cell-preferential CRISPR-Cas9 inhibition with carbohydrate-tagged oligonucleotides

　　

技术就绪度

本研究开发的碳水化合物标记的单向导 RNA 支架靶向寡核苷酸处于技术就绪度 4 级。该概念已在实验室条件下通过无细胞切割测定、多种人细胞系、内源基因组靶标、扩增子测序以及源自正常肝组织的人肝类器官得到了验证。同一种寡核苷酸抑制了测试中几种间隔序列和基因组位点的化脓性链球菌 Cas9 活性，而碳水化合物偶联提高了寡核苷酸的稳定性，并在测试模型中产生了细胞优先的抑制活性。这些结果确立了实验室规模的原理验证，但未证明全身给药后的疗效、选择性或安全性。

进一步开发需要在体内评估递送效率、生物分布、药代动力学、清除、免疫反应以及靶组织和非靶组织中的 Cas9 抑制情况。还需要确定体外观察到的细胞优先性是否在体内得以保留，以及当抑制剂成为限制因素时，持续的单向导 RNA 产生是否会恢复 Cas9 活性。载体辅助递送可能不仅改善细胞摄取和时间控制，还可能改变组织分布以及碳水化合物配体赋予的效果。在治疗使用前，应使用标准化且可重复的评估框架评估全基因组编辑结果、重复给药耐受性和长期安全性。

亮点

延长的 Cas9 活性可能增加不需要的基因组编辑，产生了一种需要在编辑机器递送后起作用的抑制剂的需求。

一种短 DNA 寡核苷酸结合化脓性链球菌 Cas9 向导 RNA 的共享结构支架，并抑制由多种测试向导和基因组靶标驱动的编辑，避免了为每个靶标重新设计抑制剂的需要。

乳糖或唾液酸标记提高了寡核苷酸的稳定性，并在选定的肝源和癌细胞模型中优先增强了抑制活性。

扩增子测序证实了人细胞和正常肝源类器官中内源基因组编辑的抑制，支持了一种模块化的化学策略，用于在不同靶标和细胞背景下控制 Cas9。

摘要

对成簇正则间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）活性的精确控制对于限制脱靶效应和染色体重排至关重要。现有的抑制剂，包括抗 CRISPR 蛋白和间隔靶向寡核苷酸，可能会受到免疫原性、靶序列依赖性或者递送挑战的限制。在此，我们开发了靶向化脓性链球菌 Cas9 单向导 RNA（sgRNA）支架保守区域而非可变间隔区的单链 DNA 寡核苷酸。筛选鉴定出单链 DNA 7（ssDNA7），它靶向茎环 1（stem-loop-1）及其相邻的连接子，并在多种测试间隔序列和基因组位点上抑制 Cas9 活性，而无需重新设计抑制剂。碳水化合物偶联提高了寡核苷酸的稳定性，并在选定的肝源或癌细胞模型中优先增强了抑制活性。扩增子测序证实了多种细胞模型和正常肝源类器官中内源编辑的抑制，并在匹配的细胞比较中支持了细胞优先抑制作用。这些发现确立了 sgRNA 支架靶向作为 Cas9 跨靶标抑制的策略，并表明碳水化合物偶联可以调节其细胞活性。

图形摘要