《Journal of Virology》：Insights into the mechanism of action of the bipartite fusion module of SARS-CoV-2 spike protein
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SARS-CoV-2进入宿主细胞由刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S-protein）介导，该蛋白促进病毒膜与宿主膜之间的融合。尽管其重要性已被广泛认可，但融合肽（fusion peptide，FP）——刺突蛋白中插入并扰动宿主膜的关键区域
SARS-CoV-2进入宿主细胞由刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S-protein）介导，该蛋白促进病毒膜与宿主膜之间的融合。尽管其重要性已被广泛认可，但融合肽（fusion peptide，FP）——刺突蛋白中插入并扰动宿主膜的关键区域——的精确定位和作用方式仍不清楚。已有两个区域被提出作为融合肽：一个位于蛋白N端（N-terminal fusion peptide，nFP），另一个位于内部位置（internal fusion peptide，iFP）。本研究中，研究人员结合计算与实验方法，表征了这两个区域的作用及其对膜融合的影响。分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟表明，nFP主要在膜表面发生相互作用。与此一致，实验生物物理分析揭示nFP对脂质囊泡（lipid vesicles）表现出低亲和力和较弱的扰动效应。相反，iFP在体外表现出更强的膜结合能力并诱导更强的膜扰动。MD模拟显示，iFP深度插入膜中并强烈影响膜结构，诱导脂质尾部外突（lipid tail protrusion）并增加穿过双分子层的水通量（water flux）。此外，携带iFP区域突变的刺突蛋白假型慢病毒（spike-pseudotyped lentiviruses）实验表明，残基Y873、F888和F906是病毒进入所必需的。综合上述发现，研究人员提出SARS-CoV-2使用一种双组分融合模块（bipartite fusion module），其中nFP与宿主膜建立初始接触并启动双分子层，使iFP能够随后深度插入并进一步 destabilize 膜结构。鉴于融合肽在病毒各科中具有保守性，其他冠状病毒中可能也存在类似的融合模块，这使得该区域成为开发广谱抗病毒治疗药物（broad-range antiviral therapeutics）的有前景的靶点。
**论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）属于冠状病毒科（Coronaviridae）β冠状病毒属（Betacoronavirus），与其同属的还有SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）、人冠状病毒OC43（HCoV-OC43）和人冠状病毒HKU1（HCoV-HKU1）等对人类健康具有重要影响的病毒。自21世纪初以来，β冠状病毒已多次引发全球性疫情。这类有包膜病毒（enveloped viruses）的感染依赖于其包膜与宿主细胞质膜或内体膜（endosomal membrane）之间的膜融合。该融合过程由刺突糖蛋白（S-protein）介导，S蛋白属于I类融合蛋白（class I fusion protein），由S1和S2两个功能亚基组成：S1负责受体结合，S2则包含驱动膜融合的分子机器。
融合肽（fusion peptide，FP）是I类融合蛋白中一段通常位于N端的、由20~30个氨基酸残基组成的疏水区域，能够插入靶膜、破坏其稳定性并启动融合过程。然而，SARS-CoV-2融合肽的确切位置一直存在争议。两个主要候选区域被提出：N端融合肽（nFP，残基816–855）和内部融合肽（iFP，残基869–905）。这两个区域在S蛋白序列中位置相近，仅相隔14个氨基酸残基。已有研究表明，nFP在双层胶束（bilayered micelles）中呈浅插入构象，其极性区域与脂质头部基团（lipid head groups）相互作用，但与脂质尾部的深层相互作用有限。而冷冻电镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）结构显示，iFP在融合后构象的S蛋白中深度插入脂质纳米盘（lipid nanodisc），呈U形构象。尽管已有这些进展，关于nFP和iFP在膜融合中的具体角色及其分子机制仍存在重大疑问。鉴于融合肽在病毒进入中的关键作用及其在冠状病毒中的保守性，阐明这一问题不仅具有重要的基础生物学意义，也为开发靶向融合肽的抗病毒药物提供理论依据。
**二、研究内容与重要意义**
为解决上述问题，研究人员整合了实验和计算两种研究策略。在实验方面，利用生物物理技术和脂质囊泡（large unilamellar vesicles，LUVs，由POPC:POPS以4:1摩尔比组成）系统评估了nFP和iFP的膜扰动效应；同时利用携带SARS-CoV-2 iFP特定氨基酸突变的刺突蛋白假型慢病毒（spike-pseudotyped lentiviruses）评估了这些残基对病毒进入的影响。在计算方面，研究人员开展了粗粒化（coarse-grained，CG）和原子级（atomistic）分子动力学（MD）模拟，以获取肽-膜和肽-肽相互作用的详细分子层面信息。
研究结果表明，虽然两种融合肽均与膜发生相互作用，但它们的作用模式截然不同：nFP较浅地插入膜表面，诱导适度的膜扰动，可能为融合启动双分子层；而iFP更深地穿透膜，表现出更强的膜 destabilization 活性。此外，iFP区域的突变可完全消除假病毒的感染性。基于这些发现，研究人员提出nFP和iFP共同作为一个功能性融合模块（bipartite fusion module）发挥作用：nFP通过膜表面相互作用启动膜接触，促进iFP的深度插入，随后iFP destabilize 膜结构，最终推动病毒包膜与宿主细胞膜的融合。这一发现揭示了SARS-CoV-2 S蛋白介导膜融合的分子机制，鉴于冠状病毒融合机制的保守性，该双组分融合模块可能代表了冠状病毒的普遍特征，为开发靶向该高度保守且功能关键区域的广谱抗病毒策略提供了新的思路。
**三、关键技术方法**
本研究采用了多种互补的技术手段。在生物物理实验方面，使用稳态荧光光谱（steady-state fluorescence spectroscopy）通过监测芳香族氨基酸残基的内源荧光变化来测定肽的脂质膜分配系数（partition coefficient，Kp）；利用基于F?rster共振能量转移（FRET）的方法评估肽诱导的脂质混合（lipid mixing）；通过5,6-羧基荧光素（5,6-CF）去淬灭法测定脂质囊泡内容物泄漏（content leakage）；采用动态光散射（dynamic light scattering，DLS）监测肽诱导的囊泡聚集。在病毒学实验方面，以SARS-CoV-2 D614G变体（B.1谱系）为野生型参考，通过钙磷转染法在HEK293ET细胞中制备携带野生型或突变型S蛋白的假型慢病毒，利用稳定表达人ACE2的HEK293T细胞（HEK293T-ACE2）进行受体结合实验和感染性实验，通过流式细胞术定量检测GFP阳性细胞比例以评估病毒进入效率。在计算模拟方面，运用Martini 3力场进行粗粒化MD模拟（30 μs）以探索肽在膜中的寡聚化行为，随后将CG模拟的最终构象转换为原子级细节，使用CHARMM36m力场进行原子级MD模拟（1 μs，三次独立重复），并采用HOLE方法和fluxer.py脚本分析水分子跨膜通量。
**四、主要研究结果**
**（1）nFP和iFP表现出不同的膜亲和性**
通过稳态荧光光谱检测肽的脂质膜分配行为，结果表明iFP-K（带有C端多聚赖氨酸尾以改善溶解性的iFP）表现出最高的膜亲和性，分配系数Kp为(2.4 ± 0.58) × 10
3；nFP和nFP-K的最大Kp值均为3.3 × 10
2；而未经修饰的iFP由于在水溶液中高度自聚集，膜结合极弱或无荧光发射变化，无法进行Kp拟合。多聚赖氨酸尾对nFP的膜分配行为影响不大，但显著改善了iFP的溶解性，减少了其在水溶液中的自聚集，使其更接近S蛋白中iFP的真实行为。
**（2）iFP促进脂质混合和脂质囊泡内容物泄漏**
FRET实验结果显示，iFP-K诱导了约15%的脂质混合，而nFP、nFP-K和iFP仅诱导约2%的微弱脂质混合。在囊泡内容物泄漏实验中，iFP-K表现出浓度依赖性的泄漏增强效应，在最高肽脂比下达到90%的泄漏率。相比之下，iFP和nFP-K在最高测试浓度下仅诱导约15%的适度泄漏，nFP则无可检测效应。
**（3）iFP诱导脂质囊泡聚集**
DLS分析表明，iFP和iFP-K均引起囊泡粒径分布的浓度依赖性增加（即流体动力学直径D
H增大）。nFP和nFP-K未诱导明显的囊泡聚集。值得注意的是，nFP-K在水溶液中形成微米级大团簇，而nFP则部分沉淀；但两者表现出相同的膜分配常数和膜扰动效应，表明脂质-肽相互作用主导了肽-肽相互作用。
**（4）iFP F898是S蛋白掺入假病毒颗粒的关键残基**
研究人员构建了携带iFP芳香族残基突变的刺突蛋白假型慢病毒。Western blot分析显示，大多数突变体成功掺入了S蛋白，但携带F898突变的假病毒中未检测到S蛋白，提示F898可能在维持S蛋白稳定性或其掺入过程中发挥关键结构作用。
**（5）iFP的Y873、F888和F906是病毒进入所必需的残基**
受体结合实验表明，11种可检测到S蛋白的假病毒颗粒均能与HEK293T-ACE2细胞表面的ACE2结合，表明突变未破坏S蛋白的融合前构象和受体结合能力。感染性实验结果显示：F888或F906突变导致假病毒完全丧失感染能力；Y873A突变也完全消除了感染性，但Y873F替换可部分保留感染性，且Y873F/Y904F双突变体仍保留可检测的进入能力；W886突变为丙氨酸或其他芳香族残基均导致感染性下降约50%；Y904A突变仅引起中等程度的感染性降低。这些结果表明iFP中的芳香族残基在膜融合过程中具有关键功能。
**（6）CG MD模拟预测iFP和iFP-K在膜中形成寡聚体组装体**
在30 μs的CG模拟中，nFP和nFP-K肽在膜内聚集形成三至四个拷贝的小簇，而iFP和iFP-K系统中所有肽拷贝均参与形成更大的寡聚体组装体（oligomeric assemblies），呈跨膜束状构象。在随后的1 μs原子级模拟中，所有肽均稳定地嵌入膜内并维持聚集状态。
**（7）iFP和nFP在MD模拟中表现出不同的膜扰动效应**
膜厚度分析显示，nFP和nFP-K的存在导致膜变薄，与其楔形构象一致。而iFP和iFP-K对膜厚度影响极小。然而，在脂质尾部外突（lipid tail protrusion）事件分析中，iFP和iFP-K诱导的外突事件数量约为nFP和nFP-K的五倍，表明iFP具有更强的膜扰动能力。两种融合肽可能通过不同机制扰动膜：nFP变体通过侧向应力和膜变薄使双分子层变形，而iFP变体通过更深插入和增强脂质动力学（如脂尾外突）诱导扰动。
**（8）iFP寡聚体组装体允许水分子穿过膜**
利用HOLE方法结合fluxer.py脚本的定量分析显示，iFP和iFP-K形成的孔状结构收缩半径分别约为1.5 ?和2 ?，均超过水分子通过所需的1.15 ?半径阈值。iFP和iFP-K系统中水分子跨膜通量显著高于nFP和nFP-K系统。这些计算发现与实验中观察到的囊泡内容物泄漏现象一致。
**（9）nFP的F817和LLF基序参与膜锚定和双分子层 destabilization**
nFP N端区域（序列SFIEDLLF）在膜界面处形成α-螺旋，其中F817始终面向膜核心，与脂质酰基链直接相互作用，其位置足够深入以接触来自两个膜小叶（leaflets）的脂质尾部，可能通过拉近相对小叶的磷脂而导致膜变薄。LLF基序（L821–F823）中，两个亮氨酸残基侧链也面向内侧并与两个小叶的脂质尾部相互作用，而F823则在面向内侧和外侧之间交替，主要与磷脂头部基团相互作用。LLF基序在冠状病毒中高度保守，突变研究已证实该基序中任何残基的替换都会显著降低或完全消除融合活性和病毒感染性。
**（10）iFP残基介导膜牵拉机制并稳定寡聚体组装体**
与nFP不同，iFP和iFP-K完全嵌入脂质双分子层。N端螺旋（残基869–873，序列MIAQY）主要与下小叶的磷脂头部基团相互作用，诱导下小叶向内突出，表现出一种“牵拉”效应，将内侧小叶向上拉，促进膜弯曲和不对称。中间基序（残基886–888，序列WTF）与双分子层两个小叶的头部基团均发生相互作用，桥接跨膜中平面的极性头部基团，促进局部双分子层变薄和 destabilization。两个谷氨酰胺残基（Q895和Q901）以及C端残基Y904和R905主要与上小叶头部基团相互作用，充当膜锚定点，稳定肽在双分子层内的取向。寡聚体组装体通过分子间氢键（如Q872与Y873、T883、S884之间）和疏水簇（如P897和M900介导）得以稳定。
**五、总结与结论**
本研究整合生物物理和计算手段，系统阐明了SARS-CoV-2两个融合肽候选区域——nFP和iFP——的膜相互作用特性。体外数据表明，nFP和nFP-K与膜结合较弱，MD模拟提示它们诱导中度膜变薄，与其在融合启动中的潜在角色一致：N端F817残基作为锚定点，保守的LLF基序更深地位于膜内并促进跨小叶脂质相互作用，可能局部 destabilize 双分子层。相反，iFP-K表现出更高的膜亲和性和更显著的膜扰动，包括跨膜内容物通量。模拟揭示iFP和iFP-K的不同区域与两个膜小叶的磷脂相互作用，产生“膜牵拉”效应。此外，携带iFP芳香族残基突变的假病毒表现出显著降低的感染性，而S蛋白仍保持功能性融合前构象，凸显了这些残基及iFP整体在高效病毒进入中的关键作用。综合上述发现和近期冷冻电镜结构数据，研究人员提出nFP在融合早期阶段发挥作用，启动膜接触并促进iFP的深度插入，随后iFP destabilize 膜结构以驱动膜融合，最终两种肽的协同作用可能导致S蛋白转变为稳定的融合后构象。
研究结论（翻译自原文Conclusion部分）：本研究中，研究人员结合生物物理和计算方法，阐明了两个被提出的SARS-CoV-2融合肽——nFP和iFP——的膜相互作用特性。体外数据表明，nFP和nFP-K与膜结合较弱，MD模拟提示它们诱导适度的膜变薄，与其在膜融合启动中的潜在作用一致。N端F817残基充当锚定点，而保守的LLF基序更深地位于膜内，促进跨小叶脂质相互作用，可能局部 destabilize 双分子层并促进后续膜融合步骤。相反，体外生物物理分析显示，iFP-K表现出更高的膜亲和性并诱导更显著的膜扰动，包括跨膜内容物通量。模拟表明，iFP和iFP-K的不同区域与两个膜小叶的磷脂相互作用，产生“膜牵拉”效应，可能促进膜融合。此外，携带iFP芳香族残基突变的假病毒表现出显著降低的感染性，尽管S蛋白仍保持功能性融合前构象，这强调了这些残基及iFP整体在高效病毒进入中的关键作用。总体而言，本研究推进了对SARS-CoV-2 S蛋白介导膜融合和病毒进入的分子机制的理解。鉴于S蛋白融合机制在冠状病毒中高度保守，本文揭示的机制可能代表冠状病毒融合肽的普遍特征，为理解该病毒科如何实现膜融合提供了更广泛的见解。这些发现也可能有助于开发靶向S蛋白这一高度保守且功能关键区域的抗病毒策略。
