狂犬病病毒P蛋白通过与宿主蛋白Snapin互作激活GSK3β-NF-κB信号通路促进病毒复制

《Journal of Virology》：RABV P protein activates the GSK3β-NF-κB signaling pathway to promote viral replication by interacting with the host protein Snapin

　　

狂犬病病毒（RABV）是一种致命的嗜神经病原体，其依赖与宿主的相互作用来维持神经元感染；然而，它如何平衡复制与神经元存活尚不清楚。在此，研究人员揭示了Snapin（一种神经元运输调节因子）是RABV增强神经侵袭的关键宿主因子。研究人员发现，RABV感染上调了N2a细胞中Snapin的表达，并且Snapin能够以剂量依赖性方式促进RABV CVS11和SRV9毒株的复制。机制研究表明，RABV P蛋白通过其C末端结构域（172–297 aa）与Snapin的37–78 aa结构域相互作用，以Snapin依赖性方式招募糖原合酶激酶3β（GSK3β），形成三元复合物。复合物形成后，GSK3β Tyr216位点的磷酸化水平升高，导致NF-κB通路的激活。这种激活通过上调神经元稳定性基因（Septin2, B4gat1和Disc1）而不诱导干扰素应答来增强病毒复制。体内研究表明，在受感染的小鼠中敲低Snapin可延缓临床症状发作并提高宿主存活率。这项研究揭示了一种独特的策略，其中RABV利用Snapin作为分子支架，将P蛋白与GSK3β/NF-κB信号连接起来，将病毒复制与神经元稳态耦合。研究人员的成果确定了一个用于狂犬病治疗靶向的宿主依赖性轴，并为理解利用类似机制的嗜神经病原体提供了更广泛的意义。

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研究背景与科学问题

狂犬病是由狂犬病病毒（RABV）引起的一种致命性脑炎，一旦出现临床症状，死亡率接近100%。RABV作为一种嗜神经病毒，其独特之处在于能够通过逆行轴突运输进入中枢神经系统（CNS），并在早期感染阶段维持神经元的完整性以支持自身复制。尽管已知RABV通过其结构蛋白（如P蛋白抑制干扰素信号、M蛋白抗凋亡等）发展出多种免疫逃逸策略，但其如何在复制的同时精确调控神经元稳态、避免过早引发神经元死亡的分子机制仍不完全清楚。特别是，RABV如何利用宿主因子来协调这一复杂过程，是当前研究的重点和难点。先前的研究表明，宿主蛋白Snapin在维持神经元稳态及多种病毒的复制周期中扮演重要角色，但其在RABV感染中的功能尚属空白。因此，本研究旨在探究Snapin在RABV感染中的作用及其潜在的分子机制。

研究方法与技术路线

为阐明上述问题，研究人员综合运用了一系列关键的分子生物学和病毒学技术。首先，通过定量实时PCR（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测RABV感染后Snapin的表达变化及其对病毒复制的影响。其次，采用免疫共沉淀（Co-IP）和激光共聚焦显微镜技术鉴定并验证RABV P蛋白与Snapin之间的特异性相互作用，并通过构建一系列截短突变体精细定位了相互作用的關鍵结构域。随后，通过转录组测序（RNA-seq）结合京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，筛选出受Snapin调控的下游信号通路。进一步地，利用免疫沉淀联合质谱分析（IP-MS）鉴定与Snapin/P蛋白复合物互作的宿主蛋白，并通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建基因敲除细胞系，结合特异性抑制剂处理，深入验证了GSK3β/NF-κB信号轴在该过程中的核心作用。最后，通过在小鼠脑内注射腺相关病毒（AAV）构建Snapin敲低的动物模型，并进行颅内攻毒实验，从体内水平验证了Snapin对RABV致病性的影响。

研究结果

1. 1.
   Snapin促进RABV感染：研究发现，RABV感染N2a细胞后，Snapin的mRNA和蛋白水平均显著上调。过表达Snapin能以剂量依赖性方式显著增加RABV的mRNA、蛋白水平和病毒滴度，而通过siRNA敲低Snapin则产生相反效果，证实Snapin是RABV复制的正调控因子。
2. 2.
   宿主蛋白Snapin与RABV P蛋白相互作用：Co-IP实验证明，Snapin特异性地与RABV的P蛋白相互作用，而非其他结构蛋白（N、M、G）。这种相互作用在病毒感染的内源性条件下也得到证实，且两者在细胞质中共定位。通过构建一系列P蛋白和Snapin的截短突变体，研究人员精确定位了P蛋白的C端结构域（尤其是172–218 aa区域）和Snapin的37–78 aa区域是介导二者相互作用的关键结构域。
3. 3.
   Snapin通过与P蛋白互作激活NF-κB通路并上调下游基因表达：转录组分析显示，Snapin调控的差异表达基因主要富集于NF-κB信号通路。研究发现，只有在RABV感染的情况下，Snapin才能协同P蛋白激活NF-κB通路（表现为p65磷酸化水平升高）。使用NF-κB通路抑制剂JSH-23可逆转Snapin介导的病毒复制促进作用。重要的是，Snapin/P复合物激活NF-κB通路并未引起典型的炎症因子应答，而是特异性地促进了与神经元发育和稳定性相关的基因（Septin2, B4gat1, Disc1）的表达。功能获得和缺失实验进一步证实，这些基因本身也能促进RABV的复制。
4. 4.
   Snapin/P复合物通过招募GSK3β并调控其磷酸化状态来调节NF-κB通路：IP-MS鉴定出GSK3β是Snapin/P复合物的关键互作蛋白。详细的Co-IP实验表明，Snapin、RABV P和GSK3β三者能形成三元复合物。在这一复合物中，Snapin作为分子桥接蛋白，介导了P蛋白与GSK3β的相互作用，而P蛋白与Snapin的结合不依赖于GSK3β。进一步的机制研究表明，该三元复合物的形成促进了GSK3β在Tyr216位点的磷酸化（激活态），同时抑制了其在Ser9位点的磷酸化（抑制态），从而激活了下游的NF-κB信号通路。使用GSK3β特异性抑制剂TWS119或在GSK3β敲除细胞中进行的实验，均证实了GSK3β在Snapin介导的病毒复制和NF-κB通路激活中不可或缺的作用。
5. 5.
   宿主蛋白Snapin在体内显著增强RABV复制**：在建立的Snapin敲低小鼠模型中，与对照组相比，Snapin敲低小鼠在感染RABV后表现出更轻的临床症状、更高的生存率（40% vs. 20%），并且其脑组织中的病毒载量显著降低。免疫组化染色也证实了Snapin敲低有效抑制了病毒在脑内的复制。

总结与讨论

本研究系统揭示了宿主蛋白Snapin在RABV感染中的关键促病毒作用及其分子机制。研究结果表明，RABV通过其P蛋白劫持宿主蛋白Snapin，后者作为分子支架，招募并激活GSK3β，进而磷酸化并激活NF-κB信号通路。不同于经典的促炎反应，此通路被劫持后特异性地上调神经元稳定性相关基因（如Septin2, B4gat1, Disc1），为病毒复制创造一个有利的“稳态”微环境，同时避免了干扰素应答等抗病毒防御。这一发现不仅阐明了RABV在早期感染中维持神经元完整性以促进自身复制的全新策略，而且鉴定出一个由Snapin、GSK3β和NF-κB构成的潜在治疗靶点轴。该研究对于理解嗜神经病毒如何操控宿主细胞稳态以实现高效感染具有重要的理论和潜在应用价值。研究结论指出：宿主蛋白Snapin与RABV P蛋白相互作用，激活GSK3β/NF-κB信号轴，改变下游神经元基因表达，从而在体外和体内促进RABV复制。