《Journal of Virology》：Non-neutralizing antibody responses control acute Crimean-Congo hemorrhagic fever virus infection in na?ve mice
克里米亚–刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）是一种有时可引起严重病毒性出血热（viral hemorrhagic fever，VHF），即克里米亚–刚果出血热（Crimean-Congo hemorrhagic fever，CCHF）的病原体。重症CCHF病例在死亡前通常极少甚至未产生CCHFV特异性抗体应答。然而，目前尚不清楚未能产生抗体应答是导致不良结局的原因，还是宿主应答失败的相关表现。在本文中，研究人员利用一种小鼠适应株CCHFV（mouse-adapted CCHFV，MA-CCHFV），探讨了体液免疫在免疫健全小鼠控制急性CCHFV感染中的必要性。研究人员发现，感染MA-CCHFV的小鼠产生了快速的非中和抗体应答，这与感染CCHFV的人类情况一致。此外，研究人员发现，雄性小鼠缺乏体液免疫导致近乎全部死亡，而雌性小鼠则不然。最后，研究人员确定，补体（complement）参与了抗体介导的MA-CCHFV感染控制，而激活性Fc受体（activating Fc-receptors）以及胞质Fc受体——含三重基序蛋白21（tripartite motif containing protein 21，TRIM21）则未参与其中。综上所述，研究人员的发现表明，快速体液免疫应答是初始宿主应对急性CCHFV感染的关键组成部分。
**论文解读**
**一、研究背景与问题提出**
克里米亚–刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）是一种经蜱虫（主要为璃眼蜱属*Hyalomma*）叮咬传播的布尼亚病毒类（*Bunyaviricetes*）病毒，可引起人类克里米亚–刚果出血热（Crimean-Congo hemorrhagic fever，CCHF），一种有时致命的病毒性出血热（viral hemorrhagic fever，VHF）。该疾病起病时为非特异性发热性疾病，可迅速进展为出血表现。在流行地区，由于人与蜱虫及家畜接触频繁，初始暴露常被忽视，早期症状难以识别，导致患者就诊时往往已处于晚期，此时利巴韦林（ribavirin）等治疗手段效果有限。目前尚无获批的CCHFV疫苗，治疗通常仅限于支持性护理。
决定CCHF结局的宿主因素目前了解甚少。流行病学证据表明，CCHFV可在多种动物中引起血清学阳性而不表现出明显疾病，但CCHF似乎是人类独有的疾病。在人类中，疾病表现可从无症状到严重致死，但决定疾病结局的机制尚不清楚。不良结局的风险因素与失调的炎症反应、不受控制的病毒复制、肝损伤以及极少甚至缺乏CCHFV特异性抗体应答相关。然而，一个关键问题悬而未决：未能产生抗体应答是导致不良结局的直接原因，还是宿主免疫应答失败或病理性应答的伴随现象？如果抗体确实必需，那么它们是通过经典的中和作用还是Fc效应功能来发挥控制作用，同样尚不明确。先前疫苗研究已提示针对CCHFV核蛋白（nucleoprotein，NP）的非中和抗体具有关键保护作用，而针对病毒Gc糖蛋白的中和抗体或针对GP38辅助蛋白的非中和抗体也显示出预防和治疗效果。基于以上背景，本研究旨在利用小鼠适应株CCHFV模型，评估B细胞和抗体在初始小鼠控制急性CCHFV感染中的贡献。
**二、研究内容与重要意义**
研究人员利用前期建立的小鼠适应株CCHFV（mouse-adapted CCHFV，MA-CCHFV）感染免疫健全小鼠模型，系统研究了体液免疫在控制急性CCHFV感染中的作用。研究发现，感染MA-CCHFV的小鼠能够产生快速的非中和抗体应答，且该体液免疫应答对控制急性感染至关重要。尤为重要的是，补体系统参与了抗体介导的感染控制，而激活性Fc受体（FcγR）和胞质Fc受体TRIM21则非必需。该研究表明，未能产生强有力的CCHFV特异性抗体应答可能是直接导致CCHFV感染者不良结局的原因，而非仅仅是一个相关标志，这为理解CCHF发病机制和开发治疗策略提供了重要的理论依据。
**三、关键技术与方法**
本研究采用的关键技术方法包括：使用MA-CCHFV（以10,000 TCID
50剂量经腹腔注射）感染多种基因敲除及转基因小鼠模型，包括适应性免疫缺陷小鼠（Rag1
?/?）、成熟B细胞缺陷小鼠（μMT）、特异性B细胞受体转基因小鼠（MD4）、活化诱导胞苷脱氨酶缺陷小鼠（AICDA
?/?）、分泌型IgM缺陷小鼠（sIgM
?/?）、激活性Fc受体缺陷小鼠（FcγR
?/?）、TRIM21缺陷小鼠（TRIM21
?/?）以及补体C3缺陷小鼠（C3
?/?）。C3
?/?、AICDA
?/?和野生型C57BL6/J小鼠购自Jackson实验室；TRIM21
?/?小鼠由Jackson实验室复苏后在落基山实验室建立内部繁殖群；FcγR
?/?（C57BL6/NTac背景）购自Taconic公司并内部繁殖；sIgM
?/?小鼠由Thomas Jefferson大学Gudrun Debes博士惠赠。通过全病毒颗粒酶联免疫吸附试验（ELISA）和重组蛋白ELISA检测CCHFV特异性IgM和IgG抗体；通过微量中和试验评估血清中和活性；通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）定量血液、肝脏和脾脏中的病毒RNA载量。
**四、主要研究结果**
**（一）适应性免疫是MA-CCHFV感染小鼠存活的必要条件**
研究人员发现，缺乏适应性免疫的Rag1
?/?小鼠感染MA-CCHFV后体重下降加剧，全部死亡。在感染后第6天（PI day 6），雌性Rag1
?/?小鼠血液、肝脏和脾脏中的病毒RNA载量较野生型（WT）小鼠显著升高，雄性Rag1
?/?小鼠血液中病毒载量也显著升高，肝脏和脾脏中呈升高趋势。这些数据表明，适应性免疫在感染后6天内即迅速发挥感染控制作用，缺乏适应性免疫应答导致病毒复制失控并最终致死。
**（二）MA-CCHFV感染小鼠产生快速但非中和的抗体应答**
通过全病毒颗粒ELISA检测，研究人员发现雄性和雌性小鼠在感染后第6天即产生了可检测的CCHFV特异性IgM应答，随后逐渐下降；CCHFV特异性IgG在第6天即可检出，并在第21天达到峰值。利用重组蛋白分析IgG靶向的病毒蛋白，结果显示感染后第8天即可检测到针对CCHFV NP和Gc的显著应答，且在第28天进一步增强。针对Gc的应答强度大于针对NP的应答，表明Gc是MA-CCHFV感染小鼠体液免疫的优势靶标。值得注意的是，针对GP38的应答在感染后第8天和第28天均较微弱。尽管小鼠在第8天已产生Gc特异性IgG，但此时血清中未检测到中和活性；中和活性直到第21天才显著升高。由于小鼠在第8天已开始恢复，提示中和抗体应答并非控制急性感染所必需。
**（三）体液免疫是MA-CCHFV感染小鼠存活的必要条件**
研究人员比较了WT小鼠与成熟B细胞缺陷μMT小鼠感染MA-CCHFV后的疾病表现。雄性μMT小鼠病情加重，体重下降更显著，且几乎全部死亡（近乎100%致死），表明体液免疫对雄性小鼠的存活至关重要。相反，雌性μMT小鼠仅体重下降略增，存活率未受影响（100%存活），且其体重下降幅度甚至低于WT雄性小鼠。感染后第6天，雄性和雌性μMT小鼠血液中病毒载量均显著升高，雌性μMT小鼠肝脏病毒载量也显著升高。为排除μMT小鼠因完全缺乏B细胞导致淋巴结构破坏、进而影响细胞免疫的可能性，研究人员进一步使用MD4转基因小鼠（其B细胞受体特异性针对无关抗原）进行了验证，结果与μMT小鼠相似，雄性MD4小鼠全部死亡，雌性病情加重。这些数据证实，CCHFV特异性抗体——而非仅仅B细胞的存在——是控制感染所必需的。
**（四）IgM或IgG均可防止MA-CCHFV感染小鼠死亡**
在感染后第6天WT小鼠开始恢复时，其血清中同时存在CCHFV特异性IgM和IgG。为明确何种抗体类型是控制急性感染所必需的，研究人员使用了AICDA
?/?小鼠（无法进行类别转换重组和亲和力成熟）和sIgM
?/?小鼠（不能分泌IgM但可进行类别转换重组产生IgG）。结果显示，sIgM
?/?小鼠的存活率与WT小鼠无显著差异。但雄性AICDA
?/?小鼠在感染后第7和第8天体重下降略增，8只中有2只于第6天死亡，提示早期IgG应答对于最佳感染控制是必需的。有趣的是，雄性和雌性sIgM
?/?小鼠体重下降均略低于相应的WT小鼠，而雌性AICDA
?/?小鼠在疾病后期体重也显著高于WT小鼠，提示缺乏早期IgM应答反而可能减轻疾病严重程度。综合来看，IgM或IgG任一抗体类型即足以控制MA-CCHFV感染，但早期IgG应答可能对最佳控制是必要的。
**（五）Fc受体不参与MA-CCHFV感染控制**
鉴于抗体是控制感染所必需但中和抗体在急性期尚未产生，研究人员推测Fc效应功能可能发挥重要作用。为验证此假设，研究人员分别感染了激活性Fc受体缺陷小鼠（FcγR
?/?）和TRIM21缺陷小鼠（TRIM21
?/?）。出乎意料的是，雄性FcγR
?/?小鼠在感染后第6和第7天体重下降显著减轻，雌性FcγR
?/?与WT小鼠体重下降相似，且所有FcγR
?/?小鼠均存活。雄性TRIM21
?/?小鼠疾病略有加重，体重下降呈加重趋势，8只中1只于第7天达到安乐死终点标准；雌性TRIM21
?/?在感染后第2和第3天体重下降显著加重，但此时尚无法检测到CCHFV特异性抗体，因此该阶段体重下降加剧不太可能由CCHFV特异性抗体机制介导。总体来说，TRIM21
?/?小鼠表型与WT小鼠差异轻微，表明TRIM21在初始小鼠控制急性MA-CCHFV感染中作用有限。这些数据表明，抗体介导的MA-CCHFV感染控制不需要激活性Fc受体，也不依赖TRIM21。
**（六）补体参与MA-CCHFV感染控制**
研究人员最后评估了补体缺陷小鼠中的MA-CCHFV感染。雄性C3
?/?小鼠体重下降与WT雄性小鼠大体相似，但存活率显著恶化，45%（9/20）的雄性C3
?/?小鼠死亡。雌性C3
?/?小鼠在急性期体重下降略增，但存活率未受影响。与病情加重和死亡率增加一致，雄性C3
?/?小鼠在感染后第6天血液和肝脏中病毒载量显著升高。雌性C3
?/?小鼠血液病毒载量显著升高但脾脏病毒载量显著降低，提示补体在血液中控制感染的作用在两性中均存在，但在肝脏和脾脏中可能具有组织特异性效应。在感染后第6天，雄性和雌性C3
?/?小鼠的CCHFV特异性IgG应答均略有但显著受损，但该差异在感染后第21天消失。这些数据表明补体参与MA-CCHFV感染控制，而激活性Fc受体和TRIM21则是可有可无的。
**五、讨论与结论**
本研究确定了早期体液免疫在MA-CCHFV感染小鼠中的关键保护作用。研究人员利用该模型中雄性和雌性小鼠表现出的性别差异——分别代表重症和轻症疾病——来解析决定疾病结局的宿主应答。B细胞和抗体的缺失导致雄性和雌性小鼠病情均加重，表明在轻症和重症CCHFV感染中抗体均参与感染控制。然而，完全缺乏B细胞的雌性小鼠仍保留显著的感染控制能力，表现出100%存活率和低于WT雄性小鼠的体重下降幅度，这与此前雌性小鼠在同时耗竭CD4和CD8 T细胞后仍保持较好感染控制能力的报道一致。只有在完全缺乏适应性免疫（Rag1
?/?）的雌性小鼠中，疾病才呈现均一致死。上述发现支持以下假说：在重症CCHF中，细胞免疫可补偿减弱但非完全缺失的CCHFV特异性抗体应答；而在轻症疾病中，体液免疫或细胞免疫任一即足以控制感染。
研究数据与临床报道一致，即致死性CCHF病例通常在死亡前极少或未产生抗体应答，而中和抗体应答可能在急性疾病消退后数周才出现。本研究结果提示，未能产生强有力的CCHFV特异性抗体应答可能是直接导致不良结局的原因，而不仅仅是一个相关标志。关于效应机制，本研究表明补体在感染控制中发挥作用——C3
?/?小鼠病情加重且早期IgG应答受损——但其未能完全重现B细胞完全缺陷小鼠的表型（雄性μMT小鼠近乎全部死亡，而雄性C3
?/?仅45%死亡），提示还存在其他抗体效应功能参与，或多种Fc效应机制共同作用。然而，FcγR和TRIM21并非必需。
研究还存在若干局限性：不能完全排除遗传背景差异对某些细微表型的影响；补体缺陷未能完全重现B细胞缺陷表型，提示需进一步研究补体的抗病毒功能；未能检测到GP38特异性抗体应答，因此本研究尚不能涵盖GP38特异性抗体在人类急性CCHFV感染控制中的贡献。
**研究结论：** 研究人员确定了CCHFV特异性抗体在控制急性感染中的关键作用。研究结果表明，未能产生针对CCHFV的抗体应答可能直接导致不良结局。IgM或IgG均可提供保护，进一步支持中和抗体并非控制CCHFV所必需的假说。早期抗体应答的Fc效应功能（如补体激活）可能发挥关键作用。综合先前关于I型干扰素缺陷小鼠迅速死于MA-CCHFV感染的发现以及适应性免疫如何控制CCHFV的研究，这些结果支持以下假说：不同的天然免疫、细胞免疫和体液免疫应答均参与决定CCHFV的发病率和死亡率。
