肠道病毒71型通过TLR2–NF-κB信号轴驱动新生BALB/c小鼠炎症性骨骼肌损伤及TLR2抑制剂C29的保护效应研究

《Microbiology Spectrum》：Enterovirus 71 drives TLR2–NF-κB–dependent inflammatory skeletal muscle injury in neonatal BALB/c mice

　　

肠道病毒71型（EV-A71）可引起中枢神经系统之外的炎症性损伤，然而驱动EV-A71相关骨骼肌病理改变的宿主信号通路仍不甚明确。Toll样受体2（TLR2）是一种关键的天然免疫感受器，能够在感染过程中放大炎症信号。在本研究中，研究人员通过对1日龄BALB/c乳鼠连续3天腹腔接种建立了EV-A71感染模型，并于接种后6小时腹腔注射TLR2抑制剂C29。EV-A71感染诱导了显著的骨骼肌病理改变，表现为炎症细胞浸润、肌束断裂与溶解以及肌纤维横截面积减小。与此一致，EV-A71升高了骨骼肌中TLR2、核因子-κB（NF-κB）信号标志物（p65及磷酸化p65）、促炎细胞因子白介素-6（IL-6）以及病毒蛋白VP1的水平。EV-A71感染还伴随α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和III型胶原的升高，提示受损肌肉中发生了组织重塑。值得注意的是，采用C29对TLR2进行药理学抑制可显著减轻骨骼肌组织病理损伤并降低IL-6的表达。综合上述结果，这些发现支持以下模型：EV-A71激活TLR2–NF-κB关联的炎症程序，从而参与骨骼肌免疫病理损伤，并凸显TLR2作为一个可操作的宿主导向靶点用于减轻病毒相关性骨骼肌损伤。

**论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

骨骼肌约占人体总重量的40%，在维持机体稳态、实现运动和促进血液循环方面发挥着不可替代的作用。骨骼肌损伤不仅降低生活质量，还可能加剧疾病进展。病毒性感染是导致骨骼肌损伤的重要病因之一，临床上流感病毒、柯萨奇病毒等感染常引起明显的肌痛和乏力。尽管不同病毒具有不同的组织嗜性，但其引发的天然免疫激活和炎症级联反应常汇聚于若干共有的关键分子通路或节点。阐明病毒如何在骨骼肌内触发炎症信号级联反应，不仅有助于深化对病毒性肌炎发病机制的理解，也为减轻广谱病毒相关性肌肉损伤提供理论基础。

肠道病毒71型（EV-A71）是一种无包膜、正义单链RNA病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属，是手足口病（HFMD）和疱疹性咽峡炎的主要病原体之一，对5岁以下儿童尤为易感。临床上EV-A71可引起严重神经系统并发症，但在成年患者中对骨骼肌的影响往往仅限于亚临床表现。而在实验动物模型中，EV-A71表现出显著的亲肌性，可导致明显的肢体瘫痪和肌纤维坏死，这使该模型成为解析病毒诱导炎症反应的理想平台。然而，驱动EV-A71相关骨骼肌病理改变的宿主信号通路仍远未被充分阐明。Toll样受体2（TLR2）作为模式识别受体的重要成员，能够通过衔接蛋白髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）调控下游转录因子NF-κB的异常激活，促进包括IL-6在内的一系列炎症介质的表达，但TLR2在EV-A71所致骨骼肌损伤中的作用和机制尚不清楚。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在阐明TLR2/NF-κB信号通路在EV-A71诱导骨骼肌损伤中的新机制，为发现广谱病毒相关性肌肉损伤的共性信号通路和潜在治疗靶点提供关键实验依据。

**二、主要技术方法概述**

研究人员以1日龄BALB/c乳鼠为实验对象，采用EV-A71病毒株EU703812（由中国疾病预防控制中心提供）通过连续3天腹腔注射接种构建感染模型（病毒滴度为10^4.12 TCID₅₀/mL，每克体重给药25 μL）。动物随机分为对照组（n=36）、EV-A71模型组（n=36）和TLR2抑制剂C29组（n=15），对照组和模型组进一步按5、7、10和14天分为四个时间点亚组。C29组于每次病毒接种前5小时腹腔注射C29（20 mg/kg），连续10天。主要技术手段包括：苏木精-伊红（HE）染色、天狼星红染色和Masson三色染色用于骨骼肌组织病理学评估；蛋白质免疫印迹（Western blot）检测TLR2、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-p65）、IL-6、III型胶原、α-SMA及EV-A71 VP1的蛋白表达水平；免疫荧光（IF）染色进行蛋白定位和半定量分析；实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测相关基因的mRNA表达水平。

**三、主要研究结果**

**（一）新生BALB/c乳鼠EV-A71感染模型的建立**

与正常对照组相比，EV-A71感染乳鼠表现出体型消瘦、体重下降、后肢无力和瘫痪、被毛稀疏等外观改变。随时间推移，感染组乳鼠的临床评分逐渐降低，体重逐渐增加。骨骼肌组织HE染色显示，EV-A71感染小鼠肌纤维排列紊乱，出现大量炎症细胞浸润、间质水肿、肌束断裂溶解及横纹肌组织减少或消失，而正常组乳鼠骨骼肌组织结构完整、无炎症细胞浸润。这些结果表明EV-A71感染的BALB/c乳鼠存在明显的外观和病理改变。

**（二）EV-A71感染导致新生BALB/c乳鼠骨骼肌损伤**

VP1作为EV-A71病毒株的标志性蛋白，在正常组乳鼠骨骼肌组织中不表达，而在EV-A71感染后VP1蛋白水平显著升高，于感染第10天达到峰值。Western blot结果显示，EV-A71感染使乳鼠骨骼肌组织中III型胶原和α-SMA的表达显著高于正常对照组，免疫荧光结果亦证实了这一趋势。这些结果表明EV-A71感染导致了骨骼肌损伤，并伴随与纤维化相关的组织重塑标志物的上调。

**（三）EV-A71感染上调TLR2/NF-κB信号通路**

研究发现，EV-A71感染后乳鼠骨骼肌组织中NF-κB（p-p65）和IL-6的表达水平显著升高，于第10天达到最高值。经核蛋白提取试剂盒提取核蛋白后，在EV-A71感染乳鼠骨骼肌组织中检测到核内NF-κB（p-p65）蛋白水平显著增加。免疫荧光和Western blot结果显示，经TLR2抑制剂C29干预后，EV-A71感染的10日龄BALB/c乳鼠骨骼肌组织中TLR2、NF-κB（p-p65）和IL-6的蛋白表达水平均显著降低。qRT-PCR结果也显示TLR2抑制剂组的mRNA水平较感染组显著降低。综合这些结果，表明TLR2/NF-κB信号通路参与了EV-A71感染诱导的骨骼肌炎症和损伤过程。

**（四）TLR2/NF-κB通路参与EV-A71感染诱导的骨骼肌炎症和损伤**

病理学结果显示，EV-A71感染导致10日龄BALB/c乳鼠骨骼肌组织出现炎症细胞浸润等病理改变。天狼星红染色发现，与对照组相比，EV-A71感染乳鼠骨骼肌组织中胶原显著积聚，可见大量红色纤维条纹。Masson三色染色显示，正常组无胶原纤维沉积，而EV-A71感染组可见大量蓝色胶原纤维；TLR2抑制组蓝色胶原纤维条纹较感染组显著减少。Western blot和免疫荧光结果表明，正常组VP1、III型胶原和α-SMA的蛋白水平较低，EV-A71感染组显著升高，使用TLR2抑制剂后三者表达均显著下调。qRT-PCR结果显示TLR2抑制组EV-A71 VP1的mRNA水平较感染组显著降低。综合而言，TLR2/NF-κB信号通路在EV-A71感染所致骨骼肌炎症和损伤中发挥关键作用。

**四、讨论与结论**

本研究支持如下模型：EV-A71感染激活乳鼠骨骼肌中TLR2/NF-κB信号通路，进而导致炎症放大、肌纤维损伤和纤维化重塑。C29通过中断这一病理性炎症循环，减轻了肌肉炎症、改善了组织损伤、减少了纤维化改变，并降低了EV-A71病毒复制相关信号。值得注意的是，C29处理后VP1水平的降低可能并非简单地源于TLR2直接促进病毒复制，而更可能反映了TLR2信号抑制后宿主代谢和炎症微环境的综合变化——TLR2相关信号可通过Akt–mTOR等通路调控免疫细胞的糖酵解，而EV-A71的复制依赖于宿主细胞的代谢重编程和膜性复制细胞器的形成，因此C29对TLR2信号的抑制可能改变了支持病毒复制的细胞条件。此外，TLR2/NF-κB轴在该模型中可能主要参与局部炎症反应的维持和放大，而非直接发挥抗病毒效应。

研究同时指出，EV-A71感染还可能通过MAPK信号通路和JAK/STAT信号通路等其他途径影响细胞炎症反应和免疫调控，这些通路之间的交叉调控是未来研究的重点方向。

本研究也存在若干局限性：主要基于BALB/c乳鼠感染模型，鉴于乳鼠与人类儿童患者在免疫发育和骨骼肌成熟度方面存在差异，相关结论尚需临床样本和更广泛动物模型的验证；主要通过药理学抑制剂C29抑制TLR2信号，尚需TLR2基因敲除、细胞特异性敲除或体外遗传干预实验进一步明确因果关系；C29处理后VP1降低的具体机制有待结合病毒滴度测定、复制中间体分析和时间进程观察加以区分。

**研究结论**：EV-A71可在哺乳期BALB/c小鼠骨骼肌中诱导促炎因子的局部浸润、肌纤维断裂以及促炎细胞因子和细胞外基质蛋白的上调。抑制TLR2/NF-κB信号通路对EV-A71诱导的哺乳期BALB/c小鼠骨骼肌损伤表现出特异性保护作用——该抑制可减少促炎因子分泌、改善EV-A71诱导的骨骼肌炎症反应，进而减少纤维化因子的分泌。因此，EV-A71可能通过TLR2/NF-κB信号通路诱导哺乳期BALB/c小鼠骨骼肌损伤。靶向该通路可能为广谱病毒诱导骨骼肌损伤的共性分子机制提供新见解，并有助于识别潜在治疗靶点。然而，EV-A71在儿童中诱导HFMD的机制十分复杂，是否有其他通路参与减轻EV-A71感染小鼠的骨骼肌损伤仍需进一步研究。