基于Kveik选育新型跨谱系酿造杂交酵母以提升工业发酵胁迫耐受性

《Journal of the American Society of Brewing Chemists》：Using Kveik to Breed Novel Interclade Brewing Hybrids with Improved Tolerances to Industrial Fermentation Stresses

　　

摘要专业翻译 应对酿造行业面临的挑战，需要开发新型酿造酵母以提高生产效率、可持续性和产品多样性。传统挪威农家艾尔酵母（farmhouse ale yeast），即kveik，因其强大的发酵特性、增强的胁迫耐受性以及独特的风味特征而受到近期关注。常用商业艾尔酵母往往存在缺陷，如胁迫敏感性或获得最佳发酵结果的适宜条件范围狭窄。本研究探索了利用选定的kveik菌株生成新型杂交酵母，作为提高酿造行业菌株多样性的概念验证。研究人员采用基于孢子的育种策略（spore-based breeding strategy），以挪威kveik和一种常用Beer 2酵母作为育种亲本，生成了三种新型杂交酿造酵母。随后利用标准麦汁（standard gravity wort, SGW）和高浓度麦汁（high gravity wort, HGW）在最佳和高温条件下进行小规模发酵，通过基因组学和以发酵为重点的表型分析揭示这些杂交酵母具有改善的能力，包括在一系列工业发酵条件下快速消耗麦汁糖类，以及部分杂交酵母相较于其亲本菌株具有高耐热性。更广泛而言，研究结果支持利用kveik开展育种策略，以生成新型酵母，拓展其在包括酿造和蒸馏在内的发酵工业中的应用。

论文解读

一、研究背景与意义

酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）已被人类使用数百年以生产啤酒等风味酒精饮料。在酿造工业化和优化过程中，酵母单培养的使用催生了一系列高度进化、适应特定酿造条件的菌株。这些酵母带有明显的驯化痕迹，基因组改变导致表型变化，如麦汁糖利用能力增强、不良风味化合物产生减少，但有性生殖能力和一般胁迫响应能力下降。此外，绝大多数艾尔酵母仅在20–24°C的狭窄发酵温度范围内使用，而能够在更高温度下生产合格啤酒的菌株很少。由于酿造行业存在创新需求，持续需要提高生产效率和产品多样性，开发新型艾尔酵母有助于解决酿造行业内菌株多样性不足的问题。

工业酿酒酵母的系统发育分析显示，大多数工业啤酒酵母聚为两大类：Beer 1和Beer 2。Beer 1群包含大多数高度驯化的传统艾尔菌株，通常适应狭窄的酿造条件范围；Beer 2群以Saison及相关比利时菌株为主，通常具有糖化能力（diastatic）并保留更强的胁迫耐受性。来自挪威西部的农家艾尔酵母（又称kveik）在遗传上形成独立于这两类的分支，近年来因其强大的发酵特性而受到关注。农家艾尔酿造实践，如较高温度（约30–40°C）和高浓度麦汁（OG约1.080）的投料、独特的酵母储存方法以及对快速啤酒生产的筛选，造就了一组能够在22–40°C范围内快速代谢麦汁糖类并具有高耐热和发酵相关胁迫耐受性的驯化酵母群。相比之下，大多数其他工业Beer 1艾尔菌株通常具有20–22°C的狭窄最佳发酵温度范围，当发酵条件未严格受控时表现不佳。Beer 2 Saison酵母具有强衰减能力（attenuation），麦芽三糖代谢高效，且通常具有糖化能力，可分泌活性Sta1葡糖淀粉酶将麦汁糊精降解为可发酵糖。然而，糖化菌株虽然能产生干爽终点的啤酒（符合Saison风格偏好），但也可能导致非预期二次发酵和过度衰减，改变风味特征并引起包装产品的喷涌。此外，许多Beer 2酵母产生酚类异味（POF），如4-乙烯基愈创木酚（4VG），这有助于特定啤酒风格（如Saison和比利时艾尔）的风味复杂性，但在大多数其他啤酒风格中被视为不良特征。

针对具有多样化性状的菌株进行定向育种和杂交可以增加特定应用的酿造酵母多样性。已有报道显示，杂交菌株在衰减速率、香气产生和胁迫耐受性方面有所改善，通常表现出杂种优势（hybrid vigor），在温度耐受性和絮凝性等性状上优于亲本，或在风味化合物产生等性状上表现出中间表型。孢子间交配（spore-to-spore mating）的高成功率和后代的基因组稳定性使其成为生成杂交菌株的首选方法。早期Beer 1酵母的驯化导致基因组退化，降低了产孢效率、孢子活力和交配能力。Beer 2酵母被认为驯化较晚，有性生殖基因的基因组退化较少。尽管许多驯化菌株存在不育现象，但一些kveik菌株可以产孢且孢子活力合理。因此，本研究旨在通过孢子间交配策略，将选定的Beer 2和kveik菌株的优良性状（如改善的麦芽三糖利用、更高的衰减速率、增强的耐热性和风味多样性）结合起来，作为利用kveik育种策略实现艾尔和Saison酵母多样化的概念验证。

二、主要技术方法

研究人员采用了孢子间交配（spore-to-spore mating）策略构建杂交菌株。具体而言，对具有已知高孢子活力和胁迫抗性的kveik酵母Hornindal 1和Granvin 1以及Beer 2 French Saison进行产孢诱导，通过四分体解剖获得单交配型孢子后代，利用多重PCR确认MAT位点组成，通过电穿孔分别导入携带潮霉素或G418抗性标记的质粒，将相反交配型的孢子转化体混合交配，经双重抗生素筛选获得杂交菌株，并通过interdelta分型（IDT）确认杂交身份。对杂交菌株及亲本进行全基因组测序（WGS），结合流式细胞术确认倍性和亚基因组组成。发酵性能评估采用标准麦汁（SGW，11.2°Plato）和高浓度麦汁（HGW，15°Plato），在22°C和37°C两种温度下进行5天小规模发酵，通过便携式密度计监测比重变化，利用高效液相色谱（HPLC）测定糖类、甘油、乙酸和乙醇含量，采用顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC/MS）分析酯类和高级醇，利用气相色谱-质谱联用（GC/MS）定量氨基酸和脂肪酸。此外，还进行了絮凝性测定、细胞活力测定（台盼蓝染色）、CRISPR/Cas9介导的FDC1基因编辑及阿魏酸消耗实验。

三、研究结果

Kveik-Beer 2跨谱系酿造杂交菌株的构建与基因组验证

研究人员将Granvin 1和Hornindal 1的孢子与French Saison孢子交配，生成三个杂交菌株：Mjolnir、NorthSeaE6和NorthSeaF4。全基因组测序的亲本特异性SNP分析确认了杂交菌株Mjolnir和NorthSeaF4的亲本来源。流式细胞术和亲本特异性SNP比例分析确认杂交菌株为三倍体，Kveik:Saison亚基因组比例为2:1，符合预期。

胁迫条件下的发酵性能

在标准麦汁（SGW）中，所有菌株在5天内均达到艾尔啤酒最低终点比重（FG）≤1.010的目标。kveik亲本菌株在37°C比22°C发酵更快，而French Saison衰减较慢但达到显著更低的FG。值得注意的是，Mjolnir在SGW中37°C条件下24小时内、22°C条件下48小时内达到SG≤1.010，是所有测试菌株中最快的；NorthSea杂交菌株在两种温度下衰减稍慢。NorthSeaF4表现出杂种优势，在SGW中具有所有测试菌株中最高的衰减度（FG<1.005）。在高浓度麦汁（HGW）中，所有菌株在37°C比22°C启动发酵更快。French Saison和杂交菌株在5天内无论温度如何均衰减至SG≤1.010，其中NorthSeaF4和Mjolnir明显更快。总体而言，NorthSeaF4和Mjolnir在所有亲本菌株中表现出改善的衰减能力，不受麦汁浓度或温度影响，且偏好37°C。

麦芽糖消耗方面，所有菌株在5天内耗尽麦芽糖，三个杂交菌株的消耗速度快于亲本。Mjolnir在37°C下24小时内几乎代谢掉两种麦汁中所有可用麦芽糖，与Granvin 1相似。基因组分析显示，French Saison含有受损的MAL1x位点，仅保留完整的MAL12（麦芽糖酶），而AGT1/MAL11（麦芽糖和麦芽三糖转运蛋白）和MAL13（转录激活因子）缺失，但MAL3x位点拷贝数增加；其麦芽糖通透酶MAL31存在p.Leu153fs无义突变的杂合二倍体状态，导致50%的Mal31通透酶可能失活。相比之下，两个杂交菌株的MAL3x位点拷贝数几乎相同且较高，p.Leu153fs突变为杂合三倍体，预测功能障碍频率低于33%，且保留了完整的AGT1和MAL13拷贝。

麦芽三糖约占可发酵麦汁糖谱的20.5%。亲本菌株中，Hornindal 1比Granvin 1更高效地消耗麦芽三糖，French Saison在两种温度和麦汁浓度下均最高效。杂交菌株的麦芽三糖消耗与French Saison相似，其中Mjolnir在所有测试条件下消耗最多。这表明Beer 2的麦芽三糖消耗性状可以育种至kveik酵母中以增强麦芽三糖消耗。

作为糖化酵母，French Saison分泌葡糖淀粉酶Sta1水解糊精和麦芽三糖。全基因组测序结果显示French Saison是糖化标记STA1及其关键UAS2启动子区域的纯合二倍体，支持其强糊精降解能力；而St. Lucifer缺乏关键UAS2，对完整STA1为杂合，5天发酵期间无显著糊精水解。kveik亲本为非糖化酵母，消耗极少糊精且缺乏糖化标记。French Saison和杂交菌株在两种温度和麦汁浓度下均消耗糊精。NorthSeaF4在37°C下比Mjolnir消耗更多糊精，尽管两者均仅含一个来自French Saison的完整STA1拷贝（含UAS2）。

代谢权衡与发酵胁迫

乙醇产生方面，所有菌株在HGW中产生更多乙醇（因糖含量更高）。French Saison和杂交菌株在所有测试条件下比kveik亲本产生更多乙醇。尽管高温下可能存在乙醇蒸发，Mjolnir在37°C产生最多乙醇，而NorthSea菌株在22°C产生最多。甘油产生方面，所有菌株在HGW中比SGW产生更多甘油（约1.5–2倍），甘油产生有助于对抗渗透压和平衡细胞内氧化还原状态。Mjolnir在24小时内甘油积累最快，并在每次发酵结束时甘油浓度显著高于所有其他菌株，其次为其亲本Granvin 1和French Saison。NorthSea杂交菌株在所有条件下产生的甘油显著少于Mjolnir。乙酸产生方面，French Saison、Granvin 1和Mjolnir在所有温度和麦汁浓度下产生最多乙酸，而Hornindal 1和NorthSea杂交菌株积累少得多。所有菌株在SGW中37°C比22°C产生更少乙酸；但在HGW中趋势逆转，French Saison、Hornindal 1和NorthSea杂交菌株在37°C产生更多乙酸，仅Mjolnir在37°C积累明显少于22°C。

耐热性方面，French Saison和NorthSea杂交菌株在37°C以上表现出显著温度敏感性。相比之下，Mjolnir在40°C和42°C下细胞活力最高（>80%），表明Mjolnir和NorthSeaF4可考虑用于较高温度应用。

工艺相关性状

氨基酸消耗方面，主成分分析（PCA）显示亲本和杂交菌株的氨基酸消耗根据测试条件聚类，表明发酵温度和麦汁浓度均影响氨基酸消耗。所有菌株在HGW 22°C条件下氨基酸消耗最完全。提高发酵温度导致两种麦汁浓度下残留氨基酸增加。kveik和Beer 2亲本在37°C两种麦汁浓度下氨基酸消耗明显分离，杂交菌株呈现中间消耗水平。

风味化合物方面，PCA显示麦汁浓度对风味化合物产生的影响在较冷发酵温度下大于较暖温度。Mjolnir在所有测试条件下与kveik亲本菌株聚类，而NorthSeaF4在22°C时聚类接近但区别于Beer 2菌株，在37°C时向kveik亲本偏移。乙酸酯在22°C HGW中通常比SGW更丰富。异戊醇在所有菌株所有条件下均超过感官阈值，乙酸异戊酯在22°C两种麦汁中达到阈值。NorthSeaF4在22°C HGW中产生高水平异戊醇和乙酸异戊酯。2-苯乙醇在HGW中所有菌株均显著高于SGW，NorthSeaF4是产量最高的菌株，在两种温度下均超过任一亲本。中链脂肪酸（MCFA）乙酯在HGW中通常丰度更高。kveik亲本和杂交菌株的MCFA酯含量低于Beer 2菌株但通常高于Beer 1对照。NorthSeaF4在22°C产生明显更高量的辛酸乙酯和癸酸乙酯。

絮凝性方面，French Saison絮凝性差（13%），Granvin 1和Hornindal 1分别为中等（54%）和强絮凝（87%）。杂交菌株显示中等絮凝水平（Mjolnir 25%，NorthSeaE6 54%，NorthSeaF4 65%），高于French Saison但低于kveik亲本。这表明Beer 2 Saison酵母的絮凝性可通过与絮凝性kveik菌株育种而改善。

下游菌株调整

阿魏酸消耗实验确认French Saison、French Saison孢子F4和Mjolnir消耗阿魏酸，而Granvin 1和Granvin 1孢子G2不消耗。Mjolnir的较弱消耗归因于杂合功能缺失突变Q154和W168fs。研究人员通过CRISPR/Cas9编辑FDC1生成Mjolnir（c.460C>T，Q154*），其阿魏酸消耗降低至与kveik亲本Granvin 1相似，实现POF?状态。序列数据确认了预期编辑，同时发现c.495_496insA突变（W168fs），该突变在Beer 1和kveik菌株中普遍存在，且Granvin 1对此为纯合。这一组合变化可能源于Granvin 1同源染色体作为Cas9诱导双链断裂的同源定向修复模板。

四、讨论与结论

本研究表明，kveik-Saison杂交菌株具有多种蒸馏行业高度期望的性状，包括快速发酵、用于麦芽和谷物威士忌的强麦芽三糖代谢、提高提取率、高浓度发酵、适应36–38°C（力争40°C）发酵的耐热性、用于风味导向烈酒（威士忌、朗姆酒和白兰地）的更多风味活性化合物，以及用于中性烈酒（伏特加和杜松子酒）的较少香气复杂性。研究人员强调kveik杂交是探索蒸馏酵母多样化的可行策略，同时承认概念验证育种策略未包括通气、投料速率、营养补充以及更大温度和麦汁浓度范围等变量，这些应在商业应用前进行严格测试。

虽然从自然界获取新菌株耗时且许多野生菌株不适合工业使用，但近期公众对转基因（GMO）酵母的态度有所缓和。具有明确酿造特性的艾尔菌株杂交是增加酿造行业菌株多样性的可行方法，同时尊重消费者和酿酒师/利益相关者对GMO的犹豫以及禁止在消费产品中使用GMO的严格地方法规。研究人员证明孢子间育种是kveik菌株杂交的有效技术，可产生具有强发酵和胁迫耐受特性的独特杂交菌株，有望大幅增加酿造和蒸馏行业的菌株多样性。由于糖化活性限制了在某些酿造场景中的适用性，未来研究应包含选择非糖化变异株以提高市场适应性。