外源核糖核酸酶A（RNase A）对啤酒花潜隐类病毒（HLVd）感染的大麻营养生长影响的评估

《Canadian Journal of Plant Pathology》：Evaluation of the effects of exogenously applied RNase A on the vegetative growth of hop latent viroid-infected Cannabis sativa

　　

可持续农业强调资源保护、生态系统韧性、最小化环境影响以及有效的植物病害管理。啤酒花潜隐类病毒（HLVd）是一种环状单链RNA病原体，对大麻作物构成日益严重的威胁，导致生长迟缓和花品质下降，同时大麻素和萜烯产量显著降低。本研究调查了在营养生长阶段，外源核糖核酸酶A（RNase A）施用对HLVd感染的大麻植株生长的影响。一项完全随机设计评估了在为期14天的水培溶液中，不同外源RNase A浓度（6、9和12 μg mL-1）下的植物生长响应。与未处理的HLVd感染植株相比，RNase A（12 μg mL-1）处理组在株高、鲜叶质量以及茎的鲜重和干重方面均显著更高（p < 0.05）。在多个案例中，这些生长参数在统计学上与观察到的健康无HLVd植株相似。RT-qPCR分析表明，在所有RNase处理的植株中仍可检测到HLVd，且类病毒载量无显著降低。对营养液的分析显示，外源RNase A有效降解了HLVd，因为在任何处理溶液中12小时后均未检测到扩增信号，而在未处理的对照组中HLVd仍然可被检测到。这些发现表明，虽然外源RNase A在植物系统中不能有效消除HLVd感染，但它可以降解水培系统中的胞外类病毒RNA，并可能降低通过循环营养液传播的风险。本研究为进一步探索基于RNase的方法来管理高价值作物的类病毒感染奠定了基础。

论文解读文章

研究背景与目的

啤酒花潜隐类病毒（HLVd）是一种环状单链RNA病原体，已成为全球大麻产业的主要威胁。该病害主要通过无性繁殖或受污染的工具机械传播，并在水培系统中可通过根部感染在植株间扩散。HLVd感染会导致大麻植株节间缩短、叶片缩小、生长迟缓、叶绿素含量降低，并显著减少大麻素和萜烯的产量，造成巨大的经济损失。此前的研究已证实，核糖核酸酶（RNase）在植物的防御机制中发挥作用，例如，在烟草中异源表达RNase基因可增强其对黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性。此外，已有体外实验证明RNase A能够完全降解纯化的HLVd RNA。然而，将RNase应用于活体植物系统以控制HLVd感染的效果尚不明确。鉴于HLVd在水培系统中易于通过循环营养液传播，本研究旨在评估向营养液中添加外源RNase A对HLVd感染的大麻植株在营养生长期内生长参数的影响，并探究其能否通过降解营养液中的胞外类病毒RNA来阻断其传播途径。

主要技术方法

研究人员采用了完全随机设计的实验方案，共设置五个处理组：健康对照（Control）、HLVd感染未处理组（NT）以及三个不同浓度的外源RNase A处理组（6、9、12 μg mL^-1）。实验在深水培养（DWC）水培系统中进行，持续14天。主要关键技术方法包括：

1. 1.
   植物材料准备与侵染：以大麻品种‘The New’为模型植物，通过从感染HLVd的根组织中提取汁液，注射入母本植株维管束的方式建立HLVd感染体系。
2. 2.
   外源RNase A处理：将来源于牛胰腺的RNase A按设定浓度直接添加到水培营养液中，每48小时更换一次营养液并重新添加RNase A。
3. 3.
   病毒检测：采用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术，分别对植物根组织和水培营养液中的HLVd进行定性和半定量检测，通过循环阈值（Ct值）的变化评估病毒载量。
4. 4.
   植物生长参数测定：测量了株高、茎粗、分枝数、叶面积、各器官（根、茎、叶）的鲜重和干重，以及叶片中叶绿素a和b的含量。

研究结果

1. 株高、分枝数、茎直径及茎的鲜重和干重

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  结论：线性模型方差分析显示，处理对株高、茎直径、茎鲜重和茎干重有显著影响（p < 0.05），但对分枝数无显著影响。Tukey-Kramer检验表明，12 μg mL^-1 RNase A（RNase-12）处理组的株高显著高于未处理感染组（NT）和健康对照组（Control）。在茎的鲜重和干重方面，RNase-12处理组与健康对照组无显著差异，且显著优于NT组和低浓度RNase A处理组。这表明最高浓度的RNase A处理能有效缓解HLVd感染导致的茎部生长抑制。

2. 叶片和根的鲜重与干重

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  结论：处理对鲜叶重、干叶重、鲜根重和干根重均有极显著影响（p < 0.0001）。RNase-12处理组的鲜叶重与健康对照组无显著差异，且显著高于NT组。但在干叶重方面，所有感染处理组（包括RNase-12）均显著低于健康对照组。对于根系生物量，虽然总体处理效应显著，但存在显著的实验批次与处理间的交互作用，表明根系响应在不同实验重复间表现不一致。

3. 叶绿素a和b含量及叶面积

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  结论：健康对照组的叶绿素a、b含量和叶面积均显著高于所有HLVd感染的处理组（NT、RNase-6、RNase-9、RNase-12）。而各RNase A处理组与NT组之间在这些指标上均无显著差异。这说明外源RNase A处理未能改善由HLVd感染引起的叶绿素合成障碍和叶片发育不良。

4. 植物组织中HLVd的检测

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  结论：RT-qPCR结果显示，在处理前后，各感染组（NT、RNase-6、RNase-9、RNase-12）的Ct值虽有微小波动（如增加14.1%），但变化均无统计学意义（p > 0.05）。这表明在为期14天的实验周期内，外源RNase A处理未能有效清除或显著降低大麻根组织内部的HLVd病毒载量。

5. 营养液中HLVd的检测

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  结论：在含有HLVd的营养液中加入RNase A后12小时，所有浓度处理组（RNase-6、RNase-9、RNase-12）均无法再检测到HLVd的扩增信号，而未添加RNase A的对照组中HLVd依然可被检测到。这有力地证明了外源RNase A能够高效降解水培营养液中的游离HLVd RNA。

讨论与结论总结

讨论部分指出，尽管最高浓度（12 μg mL^-1）的RNase A处理显著改善了HLVd感染大麻的部分生长指标（如株高、茎和叶的鲜重），使其接近健康植株水平，但这并非通过直接抑制细胞内类病毒感染实现的，因为RT-qPCR显示病毒载量并未降低。研究人员推测，这种生长促进效果可能源于RNase A对根际环境的间接影响，例如改变营养动态、调节微生物群落或引发与水吸收相关的生理应激反应。然而，由于缺乏RNase A处理的健康植株对照组，无法确定这些效应是否特异于感染植株。同时，RNase A处理未能恢复因感染而受损的叶绿素含量和叶面积等光合相关性状。与植物组织内的无效相反，RNase A在营养液中展现了强大的降解能力，能在12小时内使HLVd RNA降至不可检测水平，这与先前体外降解实验的结果一致。这一发现对于防止HLVd在水培系统的循环营养液中通过根部传播具有潜在的应用价值。

结论部分总结道，这是首次探索将外源RNase A作为缓解大麻HLVd感染所致生长减产的策略。研究表明，外源RNase A处理可以将水培营养液中的HLVd降至不可检测水平，但其无法消除植株体内的感染，也未能证明其可作为直接的病害防控手段。尽管如此，12 μg mL^-1的RNase A处理确实与某些生长参数的改善相关联。未来的研究需要更长的处理周期、更大的样本量以及包含RNase A处理的健康对照组，以阐明其作用机制并评估其在循环水培系统中减少病毒传播的实际效能。