《mSystems》：Glutathione acts as an exometabolite that promotes growth recovery in fission yeast with defects in amino acid metabolism and cell polarity
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自然界中的微生物通过互利共生、竞争等多种相互作用形成群落，以适应其生态环境。这些相互作用似乎由胞外代谢物（exometabolites）所介导，然而其背后的化学与生物学多样性在很大程度上仍未被探索。在本研究中，研究人员通过利用3,420个可行基因缺失突变体进行
自然界中的微生物通过互利共生、竞争等多种相互作用形成群落，以适应其生态环境。这些相互作用似乎由胞外代谢物（exometabolites）所介导，然而其背后的化学与生物学多样性在很大程度上仍未被探索。在本研究中，研究人员通过利用3,420个可行基因缺失突变体进行全基因组筛选，考察了裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中外代谢物介导相互作用的化学基础。研究人员鉴定了37个在单一培养（monoculture）的极限培养基上表现出生长缺陷、但在野生型菌落附近（共培养，co-culture）表现出生长恢复的菌株，提示野生型细胞来源的外代谢物补偿了基因缺失。通过溶剂分配法获得的野生型培养上清液的亲脂性组分和水溶性组分均能促进生长恢复。在由水溶性组分挽救的11个突变体中，6个为半胱氨酸营养缺陷型，这促使研究人员利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析含巯基代谢物，结果揭示培养上清液中存在谷胱甘肽（GSH）。在大多数菌株中，GSH作为营养来源恢复其生长。相比之下，在缺失Bin/amphiphysin/Rvs（BAR）适配蛋白Hob3的hob3?突变体中，GSH通过一种不依赖营养的机制挽救了细胞形态缺陷。本研究通过鉴定GSH为一种影响细胞过程并可能塑造微生物群落的外代谢物，增进了对粟酒裂殖酵母（S. pombe）中外代谢物介导相互作用的理解。
**论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
微生物在自然界中通过分泌多种胞外代谢物（exometabolites）来影响群落行为，这些代谢物既包括已深入研究的信号分子（如交配信息素、群体感应自诱导物、抗生素等次级代谢物），也包括氨基酸、有机酸等参与细胞合成代谢与分解代谢的初级代谢物。近年研究表明，胞外初级代谢物在细胞间相互作用中发挥重要作用，例如代谢物交换可参与耐药性获得和寿命延长。然而，由于外代谢物介导的相互作用在实验上难以检测，尤其是在同种细胞间难以区分供体与受体细胞，因此其分子基础仍不清楚。裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）是一种重要的真核模式生物，具备完整的基因缺失突变体文库和ORFeome文库等基因组资源，但其细胞间通讯研究仍十分有限，除肽信息素介导的交配以及自毒素外，已知的外代谢物仅包括氮信号因子（nitrogen signaling factors, NSFs）——一类能够解除氮代谢物阻遏（nitrogen catabolite repression, NCR）的oxylipins。此前研究发现，在共培养条件下，野生型细胞分泌的NSF可挽救缺乏支链氨基酸转氨酶基因eca39的突变体（eca39?）的生长缺陷，这种突变体在单培养中无法生长、但在共培养中恢复生长的现象被称为“适应性生长”（adaptive growth）。基于此，研究人员推测，通过筛选新的突变体-野生型组合，可以发现新的外代谢物。本研究的科学问题正是：哪些外代谢物能够补偿特定基因缺失突变体的生长缺陷，其化学本质和生物学功能是什么？
**二、研究内容与主要结论**
研究人员利用包含3,420个单倍体基因缺失突变体的文库，在EMM2极限培养基上进行了全基因组筛选。第一步，比较突变体在YES丰富培养基和EMM2上的生长，获得77株在EMM2上生长受损但YES上可检测到生长的菌株；第二步，将这77株突变体接种于野生型菌落附近的EMM2琼脂培养基上共培养，筛选出32株表现出适应性生长的菌株，再补充线粒体呼吸相关突变体，共获得39株；第三步，通过菌落PCR确认基因敲除，并在27°C下验证适应性生长的可重复性，最终确定了37个基因缺失突变体，它们在EMM2单培养中生长不良，但在野生型菌落附近可恢复生长。基因本体（GO）分析显示这些基因富集于线粒体ATP合成耦联的电子传递和含硫氨基酸生物合成过程；网络分析也鉴定出线粒体相关蛋白和硫代谢相关蛋白两个蛋白簇。随后，研究人员检测了NSF对这37株突变体的效应，发现14株可在NSF存在下恢复生长，但其余23株无响应。对野生型培养上清液进行溶剂分级（乙酸乙酯、1-丁醇和水溶性组分）后，发现三个组分均具有生长恢复活性，提示存在多种活性代谢物。其中11个突变体由水溶性组分挽救，且其中6个是半胱氨酸生物合成基因缺失突变体（cys2?、cys11?、met1?、met8?、met10?和sua1?）。通过用巯基反应试剂BODIPY-FL maleimide标记后经液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析，研究人员在水溶性组分中检测到谷胱甘肽（glutathione, GSH）和亚硫酸盐（H?SO?）。生长回复实验表明，GSH可恢复8个突变体的生长，其中7个（cys2?、cys11?、met1?、met8?、met10?、sua1?和SPBC365.16?）将GSH作为半胱氨酸或谷氨酸的营养来源；而hob3?突变体则通过不依赖营养的机制被GSH恢复生长和形态。进一步研究发现，敲除二肽酶基因dug1可提高hob3?细胞内的GSH有效性，并部分正常化其生长速度、隔膜形态、细胞宽度和F-肌动蛋白定位；外源GSH则在dug1?背景下进一步改善这些表型。此外，其他细胞极性相关突变体（gef1?、rga4?、scd2?和rgf1?）也表现出适应性生长并被GSH恢复生长，提示GSH在维持细胞极性中具有普遍作用。这项工作鉴定了GSH作为一种外代谢物，既可作为营养源补偿特定氨基酸代谢缺陷，又能通过非营养机制挽救细胞极性缺陷，增进了对裂殖酵母中外代谢物介导细胞间相互作用的理解，并可能为微生物群落的动态调控提供新视角。
**三、主要关键技术方法**
本研究采用的关键技术方法包括：全基因组基因缺失突变体文库筛选（使用Bioneer裂殖酵母缺失文库v5.0，包含3,420株单倍体基因缺失突变体）；共培养适应性生长筛选（将突变体接种于野生型菌落附近）；培养上清液溶剂分级萃取（依次用乙酸乙酯和1-丁醇萃取，获得亲脂性和水溶性组分）；基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的巯基代谢物靶向分析（使用BODIPY-FL maleimide衍生化）；气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测NSF；基因缺失突变体构建（通过PCR介导的基因删除策略，利用潮霉素抗性标记）；荧光显微镜观察细胞形态、隔膜和F-肌动蛋白分布（使用Calcofluor white染色和lifeact-GFP探针）；细胞内GSH水平定量分析（HPLC法）。样本来源为实验室野生型菌株JY1和Bioneer缺失文库。
**四、结果分述**
* **筛选在野生型菌落附近恢复生长的突变体**：通过三步筛选，从3,420株缺失突变体中鉴定出37株在EMM2单培养中生长不良但共培养下表现出适应性生长的菌株。GO富集显示这些基因主要参与线粒体电子传递和含硫氨基酸生物合成。
* **培养上清液促进生长恢复**：对37株突变体进行NSF响应测试，14株有响应；其余23株及3株对照菌株用于上清液活性检测，其中25株的生长被培养上清液恢复。溶剂分级后，乙酸乙酯、1-丁醇和水溶性组分均显示活性，提示存在多种外代谢物。
* **鉴定GSH为功能性外代谢物**：在水溶性组分挽救的11株突变体中有6个半胱氨酸合成缺陷株。LC-MS检测到GSH和亚硫酸盐。生长实验显示GSH可恢复8株突变体的生长，且有效浓度范围宽于游离半胱氨酸，不易产生高浓度毒性。
* **GSH作为半胱氨酸和谷氨酸的来源**：通过分析GSH降解途径相关基因（dug1、hmt2、pgt1等）的缺失突变体，发现Dug1和Hmt2参与GSH降解和有机硫生成；在Cys合成缺陷突变体中敲除dug1会提高GSH的最低有效浓度，证实这些突变体利用GSH作为Cys源。SPBC365.16?突变体利用GSH作为Glu源（精氨酸前体），且GSH的有效浓度低于游离Glu。
* **GSH维持hob3?细胞的细胞极性和稳健生长**：hob3?突变体的生长恢复不依赖Cys或Glu，且敲除dug1不仅没有消除、反而增强了GSH的恢复效果；敲除GSH转运蛋白基因pgt1则完全取消了GSH的恢复作用，表明GSH本身在细胞内发挥作用。GSH处理结合dug1缺失可降低hob3?细胞的隔膜宽度、消除弯曲隔膜并减弱异常强烈的Calcofluor white信号，同时使F-肌动蛋白斑块的弥散分布恢复正常。此外，其他细胞极性突变体gef1?、rga4?、scd2?和rgf1?也显示出GSH介导的生长恢复。
* **讨论与结论**：讨论部分指出，GSH作为三肽可提供氨基酸和有机硫，且相对于游离Cys是一种化学上更安全的Cys储存形式。对于hob3?细胞，GSH的挽救作用可能与氧化还原平衡、蛋白质翻译后修饰（如肌动蛋白的谷胱甘肽化）或硫代谢途径激活有关，但具体机制尚需进一步研究。GSH的释放机制仍不明确，可能通过特定转运体主动分泌，也可能从受损细胞被动泄漏。研究结论为：通过全基因组筛选，研究人员鉴定出GSH是一种支持裂殖酵母稳健生长的外代谢物，既可作为营养源补偿特定氨基酸代谢缺陷，也能非营养性地挽救细胞极性缺陷，从而影响微生物群落行为。突变体文库的系统应用将有助于进一步揭示种内细胞间通讯的新机制。
