基于 16S 扩增子测序揭示关尼卡州干旱森林洞穴及泥潭原核生物多样性特征

《Microbiology Resource Announcements》：Characterization of prokaryotic communities in Guánica State dry forest caves using 16S ribosomal RNA gene amplicon sequencing

　　

摘要

通过16S核糖体RNA基因扩增子测序技术，研究了关尼卡州干旱森林（Guánica State Dry Forest）内四个洞穴及一个富含鸟粪的池塘（泥潭）中的原核生物多样性。不同石灰岩岩层和干燥洞穴环境中的微生物组成存在差异，显示出独特的地下原核生物群落特征。

公告

洞穴具有严苛的环境条件，包括黑暗、高湿度和营养物质匮乏（1, 2），然而它们却维持着多样化的微生物群落，这些群落参与了生物地球化学循环和生物活性化合物的生成（3, 4）。由于许多洞穴微生物难以培养，因此非培养方法能提供更全面的洞穴微生物多样性信息。关尼卡州森林具有亚热带干旱气候、适应干旱的生物多样性以及广泛的石灰岩洞穴系统（5, 6）。Cueva de los Murciélagos是一个拥有多个入口的庞大洞穴系统，其中Cueva Carita通向一个富含鸟粪的池塘-泥潭环境；水文和地质屏障在洞穴网络中形成了不同的微环境（7）。样本详细信息见表1。采集了30克表面富含蝙蝠鸟粪的土壤或池塘泥潭样本，将其装入无菌Whirl-Pak袋中，并在4°C下冷藏直至DNA提取。从每份样本中提取10克样品，将其悬浮在含有0.02克溶菌酶的20毫升Z缓冲液中。通过反复冻融循环破坏细胞，然后用2.25毫升十二烷基硫酸钠和1.5毫升胍异硫氰酸酯在65°C下处理2小时进行裂解。裂解液经离心处理后，用等体积的氯仿提取，并在-20°C下用等体积异丙醇沉淀。DNA沉淀物再次离心，用70%乙醇洗涤，风干，重新悬浮于T10E10中，然后储存在-80°C（8–11）。DNA片段通过凝胶电泳纯化至最长25 kb，根据制造商的方案使用β-Agarase I进行消化（12）。使用BioPhotometer Plus UV/Vis光度计（Eppendorf）评估DNA的质量和含量。纯化的DNA被送往Molecular Research DNA实验室（MR DNA，美国德克萨斯州Shallowater）进行bTEFAP Illumina 20K测序，目标基因区域为16S核糖体RNA（rRNA）V3–V4。扩增使用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和785R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）（13）、样品特异性条形码以及HotStarTaq Plus Master Mix Kit（Qiagen，美国）。PCR反应条件为：95°C预热5分钟；随后进行30次循环，每次循环包括95°C 30秒、53°C 40秒和72°C 1分钟；最后72°C保持10分钟。测序使用Illumina MiSeq仪器，读取长度为2 × 300 bp的配对末端序列。多重读取数据在QIIME（2026.1）中通过配对末端16S rRNA基因扩增子流程进行处理（14）。质量过滤、去噪、去除嵌合体和ASV推断使用DADA2版本2026.1.0完成，其中反向读取的5′末端切除25个碱基，并对正向和反向读取设置最大预期误差阈值为3（15）。DADA2的assignTaxonomy和assignSpecies功能不用于分类鉴定。读取数据以100%相似度进行聚类，除非另有说明，否则使用默认参数。分类采用classify-sklearn方法和SILVA v138 99%朴素贝叶斯分类器进行。较长16S V3–V4扩增子在合并和嵌合体过滤过程中可能存在较高的读取丢失和重叠减少，但保留的读取数据仍能提供原核生物多样性的一般概况。 Proteobacteria是数量最多的门，其次是Actinobacteriota、Bacteroidota、Acidobacteriota和Chloroflexi（图1）。

表1

表1

采样地点	样本ID	坐标	采集日期	SRA访问号	条形码序列	原始读取数量	通过过滤器百分比	去噪后的数据	非嵌合体读取百分比
Cueva de los Murciélagos	MUR	17° 57′16″ N, 66° 50′54″ W	2025年5月17日	SRX33109040	CCTCGCAACC	748,207	94.87	685,442	11.36
Cueva Carita	CRT	17° 57′16″ N, 66° 50′54″ W	2025年5月17日	SRX33109041	GTATAGCTGT	580,999	95.58	501,137	24.02
Cueva Ge?a La Negra	GEN	17° 57′19″ N, 66° 51′10″ W	2025年6月28日	SRX33109042	GCTACATTAG	630,023	95.51	596,350	37.32
Cueva Del Negro	NEG	17° 58′11″ N, 66° 52′35″ W	2025年6月28日	SRX33109043	TACGAATCTT	593,667	95.77	520,964	23.44
Lago de Guano	GUA	17° 57′37″ N, 66° 51′08″ W	2025年5月17日	SRX33109044	GAGTGTGCCG	506,980	95.16	427,575	27.69

图1

图1 图1显示了关尼卡州森林内四个洞穴和一个池塘泥潭中原核生物群的相对丰度。（A）条形图展示了各样本中微生物门的相对丰度，丰度低于5%的门被归为“其他”类别。（B）标出了洞穴和富含鸟粪的湖泊在关尼卡州森林的位置及其在波多黎各的地理位置。地图由ángel M. Nieves Rivera制作。

致谢

感谢洞穴学研究组织（Grupo Espeleológico del Oeste, Inc. 和 Gruta Troglodita Norman Veve, Inc.）以及Walter Díaz Rodríguez在样本洞穴的定位和 logistics 方面的协助。

Camila M. Martínez-Llaurador：负责正式分析、调查和撰写——初稿； Isabel Aguirre-Ortiz：负责正式分析、调查和撰写——初稿； Francisco J. Román-Soto：负责正式分析、调查和撰写——初稿； Naomy M. Chaparro-Mata：负责正式分析、调查和撰写——初稿； Peter A. Camacho-Nazario：负责正式分析； Tesia Lin：负责撰写、审稿和编辑； Josué Rodríguez-Ramos：负责撰写、审稿和编辑； Miguel J. Martínez-González：负责采样和审稿、编辑； Miguel Canals-Mora：负责审稿和编辑； ángel M. Nieves-Rivera：负责采样和审稿、编辑； Carlos Rios-Velazquez：负责撰写、审稿和编辑。