《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Regulation of immune signal integration and memory by inflammation-induced chromosome conformation
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三维（3D）基因组构象是基因表达调控的核心，然而研究人员对其在免疫细胞快速转录反应、信号整合和记忆中的贡献的理解仍有限。在本研究中，研究人员利用整合的转录组学、表观基因组学和染色体构象数据（包括碱基对分辨率的Micro Capture-C，MCC），研究了原代
三维（3D）基因组构象是基因表达调控的核心，然而研究人员对其在免疫细胞快速转录反应、信号整合和记忆中的贡献的理解仍有限。在本研究中，研究人员利用整合的转录组学、表观基因组学和染色体构象数据（包括碱基对分辨率的Micro Capture-C，MCC），研究了原代巨噬细胞中炎症反应的分子调控。研究人员证明，白细胞介素-4（IL-4）通过稳定地重塑3D基因组构象，将内毒素、干扰素-γ和地塞米松反应性增强子与其同源基因启动子并置，从而启动巨噬细胞的炎症反应。基于CRISPR的增强子-启动子接触或CCCTC结合因子（CTCF）边界元件扰动表明，IL-4驱动的构象变化是增强和协同的内毒素诱导转录反应以及刺激撤除后转录记忆所必需的。此外，由染色体构象变化介导的转录记忆可以在染色质可及性或组蛋白修饰无变化的情况下发生。总之，这些发现表明，对免疫刺激的快速和记忆性转录反应编码在3D基因组中。
先天免疫细胞是机体抵御病原体的第一道防线，能够快速感知并整合环境中的多种信号，产生适当的炎症反应，并在病原体清除后建立免疫记忆。巨噬细胞（macrophage，MF）作为先天免疫系统中可塑性最强的细胞之一，其经典活化（M1）与替代活化（M2）状态受多种细胞因子和病原体信号调控。以往研究主要将这种可塑性归因于“一维”（1D）表观遗传机制，如组蛋白修饰、转录因子结合和染色质可及性变化。然而，基因组三维（3D）构象——包括区室、拓扑关联结构域（TAD）以及增强子-启动子染色质环——是否参与炎症信号的快速整合和短期记忆形成，此前缺乏系统研究。这主要受限于传统Hi-C技术分辨率不足，难以精准识别增强子-启动子水平的染色质环。为此，研究人员利用碱基对分辨率的Micro Capture-C（MCC）等先进染色体构象捕获方法，结合转录组和表观基因组分析，系统探究了IL-4诱导的巨噬细胞极化、炎症信号整合与短期转录记忆中3D基因组构象的作用。
研究人员以小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）为模型，先用IL-4处理24小时诱导M2极化（M2[IL-4]），随后撤除细胞因子并静息24小时获得“启动”态巨噬细胞（M2p[pIL-4]），并设置未处理对照（M0[CTR]）。通过整合Hi-C、RNA-seq、ATAC-seq和ChIP-seq（H3K27ac、H3K4me1、H3K4me3）数据，研究人员发现IL-4广泛重塑3D基因组构象，形成超过1000个染色质环，其中约40%在细胞因子撤除后仍稳定存在，称为“记忆环”（memory loops）。这些记忆环连接信号响应性增强子与同源启动子，使细胞对后续内毒素（LPS）、干扰素-γ（IFNG）和地塞米松（DEX）刺激产生增强或协同的转录反应。CRISPR-Cas9介导的增强子或CTCF边界元件扰动证明，这些构象变化在功能上是信号整合和转录记忆所必需的。值得注意的是，某些基因（如Il6）在IL-4处理下形成稳定的染色质环，却不伴随可检测的染色质可及性或组蛋白修饰变化，提示3D基因组构象可独立于1D表观修饰编码免疫记忆。该研究揭示了先天免疫记忆的一种新编码层级，为炎症调控机制提供了全新视角。
研究方法上，研究人员使用小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），经IL-4极化、撤除和二次刺激建立模型。主要技术方法包括：Hi-C（25 kb分辨率）用于全基因组染色质环检测；Micro Capture-C（MCC）用于碱基对分辨率的启动子-增强子接触图谱绘制；RNA-seq分析基因表达，ATAC-seq检测染色质可及性，ChIP-seq检测组蛋白修饰（H3K27ac、H3K4me1、H3K4me3）；基于CRISPR-Cas9的原代巨噬细胞基因编辑，包括敲除Egr2、扰动候选增强子及CTCF结合位点；RT-qPCR验证基因和增强子RNA（eRNA）表达。所有实验均使用生物学重复，并通过置换检验评估记忆环与基因集的富集显著性。
### 研究结果
**1. 巨噬细胞极化稳定重塑3D基因组构象。**
通过Hi-C数据鉴定出1818个差异染色质环，其中1155个为IL-4诱导、663个为IL-4抑制。k均值聚类将IL-4诱导环分为瞬时环（350个）、启动环（345个）和记忆环（460个），分别与瞬时基因、启动基因和记忆基因相关联。RNA-seq相应鉴定出406个瞬时基因、282个启动基因和217个记忆基因。1D表观修饰分析显示，染色质可及性大多为瞬时变化，而H3K4me1在撤除后保留程度最高（约30%）。在代表性位点中，Arg1展示瞬时环和瞬时表观变化，F7/F10展示记忆环和持续的组蛋白修饰，而Il6位点在无明显1D表观变化的情况下形成稳定环。
**2. IL-4驱动的3D基因组重编程在无转录和1D表观变化时影响炎症基因位点。**
置换检验显示，记忆环显著富集于瞬时、启动和记忆基因附近，也富集于IL-4抑制基因附近。在905个IL-4诱导基因中，246个与记忆/启动环重叠；而4052个IL-4不敏感基因也与这些环重叠，其中约60%伴随1D表观变化，约40%仅在3D
