NMR晶体学揭示Toho-1 β-内酰胺酶与阿维巴坦复合物活性位点的质子化状态

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：NMR crystallography reveals active-site protonation states of Toho-1 β-lactamase in complex with avibactam

　　

活性位点质子化状态的确定对于全面理解酶催化和抑制机制至关重要。本研究采用NMR晶体学——固态核磁共振波谱学、X射线衍射和第一性原理计算化学的集成方法——确定了Toho-1 β-内酰胺酶与非β-内酰胺抑制剂阿维巴坦复合物活性位点的质子化状态。研究人员报道了Toho-1:阿维巴坦复合物的两个X射线晶体结构，以及能够实现近乎完整的骨架和侧链共振归属的高场固态核磁共振测量。为克服传统上阻碍NMR晶体学在大体系中的应用的计算规模限制，研究人员采用了一种加速工作流程，其中机器学习原子间势能够在密度泛函理论化学位移计算之前实现高效的几何优化。对于Toho-1，使用该混合方案对活性位点化学位移和化学位移张量进行定量分析揭示，关键活性位点侧链在阿维巴坦存在下保持其典型电荷状态，其中Lys73和Lys234质子化并带正电荷，Glu166去质子化并准备发挥广义碱的作用。与近期提出的阿维巴坦通过pKa扰动抑制关键质子转移的机制模型相反，研究数据指向一个更直接的化学根源，即Ser70-阿维巴坦氨基甲酰键对水解的内在抗性。

论文解读

一、研究背景与科学问题

β-内酰胺类抗生素通过靶向细菌膜中的青霉素结合蛋白，抑制肽聚糖生物合成，最终导致细菌死亡。为对抗这些强效抗菌药物，细菌进化出了β-内酰胺酶——一类通过水解β-内酰胺环的酰胺键而使β-内酰胺抗生素失活的酶。这些酶被分为四类：B类金属酶以及丝氨酸水解酶A类、C类和D类。其中，A类超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases, ESBLs）因其广泛的底物谱而构成尤为严重的威胁。Toho-1 β-内酰胺酶（CTX-M-44）以其对超广谱头孢菌素的高催化活性而著称。

A类丝氨酸β-内酰胺酶通过涉及共价酰化随后水解性脱酰化的两阶段机制水解β-内酰胺抗生素。Ser70侧链通过对β-内酰胺羰基的亲核攻击启动反应，形成酰基-酶中间体；脱酰化随后通过由广义碱催化激活的水分子进行。该机制的核心是由保守残基Lys73、Glu166和Ser130组成的质子转移网络，其中Ser130定位于介导氢键和质子穿梭。Lys234虽然距离较远，也被认为参与调节静电作用，并可能有助于替代质子转移途径。

为对抗β-内酰胺酶的灭活作用，β-内酰胺抗生素常与基于机制的抑制剂联合使用，如克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。然而，这些抑制剂的β-内酰胺核心本身可被日益增多的耐药A类β-内酰胺酶水解，从而再生催化活性酶。这一耐药变体的出现推动了结构上不同于β-内酰胺的抑制剂的发展。阿维巴坦（avibactam）——一种二氮杂双环烷烃—— exemplifies了这一策略：它与Ser70形成共价氨基甲酰键，模拟酰基-酶中间体，但不发生水解裂解。相反，脱氨基甲酰化触发环的再闭合，恢复完整的抑制剂，使其能够进行进一步的抑制循环。

质子转移网络和催化残基的质子化状态对A类β-内酰胺酶的机制至关重要，决定了反应途径和酶-抑制剂复合物的稳定性。中子晶体学已为催化早期阶段的质子化状态提供了原子级见解。在Toho-1中，三个中子结构捕获了静息酶（2XQZ）、四面体中间体类似物（4BD1）和酰基-酶中间体形成第一步（5A93）中的氢原子位置。这些化学上详细的结构支持Glu166和Lys73作为交替的广义酸-碱催化剂的机制。然而，抑制形式——特别是与阿维巴坦的长寿命共价复合物——中的质子化状态仍未解决。先前的机制模型，最值得注意的是基于CTX-M-14超高分辨率晶体结构（0.83 ?）的模型，提出阿维巴坦通过扰动Lys73的pK_a来抑制Lys73-Glu166质子转移，从而稳定Lys73和Glu166均为中性的非活性状态。尽管已报道了若干额外的阿维巴坦结合的A类β-内酰胺酶的高分辨率X射线晶体结构，但这些复合物迄今仍无法通过中子晶体学表征。

二、研究内容与主要结论

本研究采用NMR晶体学（NMR crystallography, NMRX）——X射线衍射、固态核磁共振（solid-state NMR, SSNMR）和第一性原理计算化学的集成应用——来解决阿维巴坦抑制的Toho-1复合物的活性位点质子化状态。研究人员报道了Toho-1:阿维巴坦复合物的两个X射线晶体结构，并辅以高场和高灵敏度低温CPMAS SSNMR实验，实现近乎完整的骨架和侧链化学位移归属。为定量解释这些数据，研究人员使用混合机器学习原子间势（machine-learning interatomic potential, MLIP）/密度泛函理论（density functional theory, DFT）方案，其中MLIP提供快速几何优化，而DFT确保高精度化学位移计算。这一可扩展框架将几何优化步骤加速了约五个数量级，将计算墙钟时间从数周缩短至数秒，同时保持了严格化学位移预测和候选结构模型定量区分所需的结构精度。

NMRX揭示，在阿维巴坦抑制的Toho-1形式中，Lys73和Glu166均保持其典型电荷状态。与近期提出的阿维巴坦通过pK_a扰动抑制关键质子转移的机制模型相反，研究数据指向一个更直接的化学根源，即Ser70-阿维巴坦氨基甲酰键对水解的内在抗性。这一修正的机制完善了当前对阿维巴坦作用的理解，并凸显了NMRX解决传统结构生物学无法触及的关键质子化状态的能力。

三、关键技术方法

研究人员主要运用了以下关键技术方法：X射线晶体学，在两种条件下解析了Toho-1:阿维巴坦复合物的晶体结构（高盐条件1.15 ?分辨率，PDB ID 9ZO2；低盐条件2.0 ?分辨率，PDB ID 9ZQQ）；高场固态核磁共振波谱学，在900 MHz和600 MHz低温CPMAS探针上采集数据，结合残基特异性¹³C,¹⁵N赖氨酸标记实现侧链归属；化学位移张量测量，采用三维化学位移放大（xCSA）实验获取Glu166 C^δ张量和二维xCSA实验获取Lys73/Lys234 N^ζ张量；以及混合MLIP/DFT计算方案——使用FAIRChem的通用原子模型（Universal Model for Atoms, UMA）进行快速几何优化，随后以B3LYP水平进行DFT化学屏蔽计算，并通过约化χ²统计量和贝叶斯UC模型概率对候选模型进行排序。样品使用R274N/R276N双突变体Toho-1 β-内酰胺酶制备。

四、研究结果

X射线晶体学：Toho-1结构显示保守的阿维巴坦结合特征

研究人员报道了Toho-1与阿维巴坦复合物的X射线晶体结构，在1.15 ?分辨率下解析（PDB ID 9ZO2）。在该结构中，阿维巴坦与亲核Ser70形成特征性的共价氨基甲酰键，生成酰基-酶中间体类似物。活性位点与阿维巴坦的相互作用与在其他CTX-M复合物中观察到的密切相似：氨基甲酰羰基氧占据由Ser70和Ser237骨架酰胺形成的氧阴离子穴；硫酸基位于与Ser130、Thr235侧链以及（弱地）Lys234和Ser237的氢键距离内；甲酰胺基与Asn132侧链形成氢键。值得注意的是，在Toho-1:阿维巴坦结构中，甲酰胺基还与活性位点入口处第二个非共价结合的阿维巴坦的硫酸基和羰基形成氢键。Glu166侧链与Asn170的甲酰胺相互作用，二者共同协调催化必需水分子，该水分子距阿维巴坦氨基甲酰碳3.0 ?。研究人员还在低盐条件下制备了第二种晶体形式（20 mM MES，pH 6.5），在2.0 ?分辨率下解析其结构（PDB ID 9ZQQ）。两种结构的蛋白骨架和活性位点几乎可完全叠加，唯一显著例外是硫酸基采用不同的旋转异构状态：在2.0 ?结构中，Ser130 β-羟基与阿维巴坦N6氮原子处于氢键距离内。

固态核磁共振：探测活性位点的化学性质

用于SSNMR的多晶样品在与2.0 ? X射线结构相同的低盐批量结晶条件和pH（6.5）下制备。SSNMR实验在900 MHz下进行，辅以600 MHz低温CPMAS探针的高灵敏度实验。研究人员采用"由外而内"方法进行化学位移归属，对均匀¹³C,¹⁵N标记样品完成全骨架和侧链共振归属。为克服赖氨酸N^ζ共振归属的挑战，制备了第二个利用残基特异性¹³C,¹⁵N赖氨酸标记的样品。共计93%（1,463/1,572）的碳和氮原子被归属，包括99.0%的骨架原子和90.6%的侧链碳原子。关键活性位点残基的侧链位移提供了质子化状态的初步评估：Lys73 N^ζ共振位于37.5 ppm，表明质子化、带正电荷的铵基侧链，挑战了先前的中性状态模型；Lys234的化学位移也最符合质子化、带正电荷的侧链；Glu166 C^δ共振位于179.1 ppm，介于带电（~182 ppm）和中性（~177 ppm）谷氨酸预期值之间，可能反映与保守活性位点水的强氢键作用。

NMR晶体学：利用混合MLIP/DFT方法解析活性位点质子化状态

研究人员系统生成了16个候选结构，改变Lys234、Lys73和Glu166的质子化状态和氢原子位置。每个模型基于2.0 ? X射线结构构建，使用基于MLIP的工作流程进行几何优化，随后进行DFT化学位移计算。仅基于各向同性化学位移的比较无法在典型[K234⁺, K73⁺, E166^?]和全质子化[K234⁺, K73⁺, E166⁰]电荷状态之间提供唯一选择。将各向同性化学位移和张量主分量纳入复合约化χ²分析后，典型质子化状态模型[K234⁺, K73⁺, E166^?]以高置信度（>93%）被确定为实验结构，而Glu166中性的替代模型不再获得统计支持（<1%）。Glu166 C^δ化学位移张量分量与带电羧酸基团的经验值密切匹配，与中性羧酸预期的显著更大跨度不一致；Lys73和Lys234的N^ζ张量分量与质子化铵基的预期值高度一致。作为独立验证，Lys73 H^ζ的¹H化学位移（7.2 ppm）直接支持抑制复合物中质子化的Lys73铵基。

机制意义：Toho-1抑制的化学基础

NMR晶体结构提供了抑制状态的化学详细快照。在该典型构型中，Lys73和Lys234质子化并带正电荷，Glu166去质子化并正确定位于发挥广义碱作用。催化必需水分子定向为对氨基甲酰碳进行亲核攻击，采用水解脱酰化之前预期的构型。然而水解并未发生，复合物保持在该长寿命抑制状态。该结构确定水解并非由活性位点质子化状态的重新配置所抑制。酶已准备好反应，能垒必须主要源于抑制剂本身的化学性质和Ser70-阿维巴坦氨基甲酰键对水解的内在抗性。氨基甲酰键本质上比β-内酰胺底物和抑制剂形成的酯键反应性低——氨基甲酸酯的水解速度比相应酯慢三到六个数量级，因为相邻氮的n→π*电子捐赠显著降低了氨基甲酰碳的亲电性。

五、讨论与结论

该结构修正了当前对阿维巴坦抑制Toho-1机制的理解。它与近期提出的抑制由活性位点pK_a扰动驱动的模型不同，后者基于CTX-M-14:阿维巴坦超高分辨率X射线晶体结构以及相关CTX-M-9:阿维巴坦复合物的溶液态NMR滴定数据。在后者中，一个pH依赖的C^ε-H^ε交叉峰被暂定归属为Lys73，其化学位移扰动被归因于Lys73去质子化，尽管该NMR交叉峰从未被明确归属。研究人员在Toho-1:阿维巴坦的溶液态谱图中观察到具有几乎相同化学位移和pH依赖性的类似C^ε-H^ε交叉峰；利用完整的化学位移归属，可以明确将该共振鉴定为Lys137而非Lys73。如果CTX-M-9交叉峰确实来自相同的保守位点，那么CTX-M-9和CTX-M-14抑制复合物中中性Lys73的NMR证据就受到质疑。相比之下，Toho-1:阿维巴坦复合物的质子化状态直接由残基特异性固态NMR可观测量确定：Lys73 N^ζ各向同性位移和张量鉴定质子化铵基，而Glu166 C^δ位移张量鉴定去质子化羧酸根。NMRX使研究人员能够以高统计置信度定量确定这些电荷状态。

Toho-1:阿维巴坦复合物的NMR晶体结构确定活性位点残基采用其典型质子化状态：Lys73和Lys234带正电荷，Glu166去质子化并准备发挥广义碱作用。活性位点看起来为水解脱酰化最优配置，催化水定位于对氨基甲酰碳进行亲核攻击。然而水解并未发生。相反，缓慢的脱氨基甲酰化导致完整抑制剂的再生。研究结果表明，阿维巴坦的抑制能力并非源于活性位点质子化状态的重新配置，而主要是阿维巴坦本身化学性质以及Ser70-阿维巴坦氨基甲酰键水解抗性的结果。这种稳定性强调了氨基甲酸酯作为药物化学中水解稳定基序的更广泛作用。被抑制的Toho-1:阿维巴坦复合物迄今无法通过中子衍射表征，而NMR晶体学使用的微晶对此类扰动更具鲁棒性，使得此前无法获得的抑制状态的化学详细表征成为可能。更广泛地说，这些结果凸显了NMR晶体学在捕获化学丰富的结构细节和解析酶机制——包括质子化状态、氢键和局部静电作用——方面的独特价值，尤其是在传统结构生物学工具无法触及的挑战性系统中。