《Metabolic Engineering》：Kinetic model of a determinate legume root nodule reveals plant metabolic characteristics for more efficient nitrogen fixation symbiosis
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•建立了限定型根瘤代谢的动力学模型。•中心碳代谢途径酶对固氮效率的影响最大。•ZWF和PEPC/PYK被鉴定为改善效率的潜在工程靶点。•高效和低效根瘤的通量图存在显著差异。引言氮是限制植物生长和作物产量的主要营养元素之一（Du等，2020）。为缓解这一生长限制并实现产量最大化
• 建立了限定型根瘤代谢的动力学模型。
• 中心碳代谢途径酶对固氮效率的影响最大。
• ZWF和PEPC/PYK被鉴定为改善效率的潜在工程靶点。
• 高效和低效根瘤的通量图存在显著差异。
引言 氮是限制植物生长和作物产量的主要营养元素之一（Du等，2020）。为缓解这一生长限制并实现产量最大化，合成氮肥被常规施用于作物。然而，化肥的径流会导致富营养化以及严重的环境破坏和生物多样性丧失（Penuelas等，2023）。某些植物，如大豆及其他豆科植物，已进化出与根瘤菌的共生关系，这种细菌能将游离氮固化为氨。在共生过程中，这些植物向根瘤菌输送碳，以换取氨。这种关系使植物能够满足其氮需求而无需依赖化肥。然而，这也要求植物将其光合作用产物的一部分提供给细菌。据估计，植物光合作用产物的13-28%可能被分配用于支持这一固氮过程（Holland等，2023；Vance，2008），而依赖化肥并从土壤中直接吸收氮的植物则不会产生这一代价。先前的建模研究表明，固氮相关的碳成本可能使大豆产量降低多达27%（Holland等，2023）。减少支持固氮所需的碳量并提高该过程的效率，可以减少其潜在的负面产量影响，从而支持更可持续的农业实践并维持作物生产力。
植物与细菌之间的代谢物交换发生在根瘤中，根瘤是专门为这一共生关系而形成的特化植物结构。在这些根瘤中，植物提供的碳以蔗糖形式存在，被转化为二羧酸盐（苹果酸、琥珀酸和延胡索酸），并转运进入已感染根瘤结构的细菌中（Engelke等，1987）。细菌利用这些二羧酸盐提供的能量，通过氮还原酶催化N2 还原为氨（Yurgel和Kahn，2004）。铵随后从细菌转运至植物根瘤细胞，通过GS/GOGAT循环同化为谷氨酸和谷氨酰胺。谷氨酸和谷氨酰胺随后在亚热带和温带来源植物中的不定型根瘤中被进一步转化为天冬氨酸和天冬酰胺，或者在热带起源豆科植物形成的定型根瘤中进入从头 嘌呤合成并被转化为脲素（Liu等，2018；Meilhoc等，2025）。
固氮效率，即支持这一共生关系所需的碳量，已被证明存在变化，大多数观察结果和模型估计值在2-8 g C g-1 N之间（Minchin和Witty，2005）。更高效的固氮可能来源于更高效、维持氮还原酶活性所需碳更少的细菌，或者来源于协调根瘤代谢途径以减少碳的低效利用。在植物方面，了解高效与低效根瘤的代谢景观可以为潜在的植物工程靶点提供依据，从而提高该过程的效率，为植物生长和产量留下更多碳。
模型是探索代谢低效性并理解代谢途径涌现行为的有用工具。尽管已开发了根瘤代谢的基于约束的通量平衡分析（FBA）模型（diCenzo等，2020；Holland等，2023），但这些模型在生物技术实用性方面存在局限，因为它们无法评估对单个酶的扰动将如何影响固氮的速率和效率。代谢动力学模型将代谢物浓度的变化描述为一组由反应通量组成的微分方程，这些通量是动力学参数以及酶和底物浓度的函数。因此，这些模型可用于理解代谢系统的非线性行为并确定代谢工程靶点。
针对不同途径和生物体已开发了动力学模型，许多早期研究聚焦于中心碳代谢或细菌系统（Chassagnole等，2002；El-Mansi等，1994；Hernández-Esquivel等，2025；Jahan等，2016；Joshi和Palsson，1989；Khodayari等，2014；Millard等，2017；Peskov等，2012；Pettersson和Ryde-Pettersson，1988；Schoeberl等，2002；Wiechert，2002）。最近，实验数据日益丰富使得在大肠杆菌 和酿酒酵母 中开发包含数百个反应的大规模模型成为可能（Khodayari和Maranas，2016；Narayanan等，2025）。在植物中，已开发了动力学模型来描述包括光合作用（He等，2024；Zhao等，2021；Zhu等，2013）、木质素生物合成（Sulis等，2023；Wang等，2018，2014）和苯并基途径（Colón等，2010）等系统中的过程并确定工程策略。这些机理动力学模型已被用于揭示单个酶对整体代谢途径行为的影响，同时也捕捉了基于约束框架通常无法涵盖的系统特征。
在此，我们提出了第一个定型根瘤代谢的酶动力学模型，并利用该模型确定提高固氮效率的潜在工程策略。该模型整合了糖酵解、三羧酸循环（TCA）、磷酸戊糖途径（PPP）、甘氨酸和丝氨酸代谢、GS/GOGAT循环、丙氨酸和天冬氨酸代谢、从头 嘌呤生物合成以及尿囊素生物合成的反应。我们采用系统性的参数采样方法来探索能产生固氮效率生物学合理预测的酶丰度空间。基于此分析，我们评估了高效与低效根瘤的不同代谢特征，并确定了预测对模型固氮效率和速率影响最大的酶。最后，我们模拟了酶敲低或过表达的两两组合，并确定了提高固氮效率和速率的潜在工程靶点。
章节片段 动力学模型构建 定型根瘤动力学模型整合了十个主要代谢途径的反应：糖酵解、三羧酸循环（TCA）、磷酸戊糖途径（PPP）、甘氨酸和丝氨酸代谢、GS/GOGAT循环、丙氨酸和天冬氨酸代谢、从头 嘌呤生物合成以及尿囊素生物合成。该模型的构建分为三个主要步骤（图S1）：(1) 从所有可用数据库中汇编定型根瘤中的已知反应，(2) 生成并参数化
定型根瘤代谢的动力学模型 采样的V max -1 N，范围为3.73–50.79 g C g-1 N（图1A），固氮速率中位数为1.00 mM s-1 ，范围为0.14–4.07 mM s-1 （图1
讨论 在本研究中，我们开发了豆科植物定型根瘤代谢的第一个动力学模型。该模型对动力学参数扰动具有鲁棒性，产生的细胞内代谢物浓度预测与已有测量数据一致，并重现了生物学上合理的固氮效率。该模型为分析通路水平通量模式和识别与提高固氮速率相关的代谢重新分配提供了平台，以及
结论 我们开发了一个详细的计算机模拟 模型来研究定型根瘤中的代谢。该模型提供了关于固氮底层代谢的关键见解并突出了关键调控节点。我们的两两扰动结果进一步揭示了固氮性能可能对定向工程策略的响应。本研究中开发的方法论可以方便地应用于研究其他具有复杂代谢系统的生物体。一个主要挑战在于
CRediT作者贡献声明 Rourou Ji： 撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，可视化，验证，软件，方法学，调查研究，正式分析，数据整理，概念化。Megan L. Matthews： 撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，指导，资源，项目管理，方法学，调查研究，经费获取，概念化。Joshua A.M. Kaste： 撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，指导，方法学，调查研究，正式分析
未引用参考文献 Chassagnole等，2002a；Chassagnole等，2002b；diCenzo等，2020；Fu等，2025；Plaxton，1996。
致谢 本研究由"农业营养共生使能项目"（ENSA）资助，该项目由
盖茨农业创新基金 提供资金支持（INV-57461）（RJ、JAMK和MLM）。图2和图4使用
BioRender.com 制作。
Rourou Ji|Joshua A.M. Kaste|Megan L. Matthews
