《International Journal of Biological Macromolecules》：Generation and evaluation of nanobodies specific for virulence proteins from
Vibrio parahaemolyticus causing translucent post-larvae vibriosis
编辑推荐：
•制备并评估了针对TPV毒力蛋白的特异性纳米抗体。•从未免疫的羊驼和鲨鱼噬菌体文库中筛选了VHH和vNAR纳米抗体。•将选定的纳米抗体整合到试纸条中用于TPV的快速检测。引言凡纳滨对虾是全球对虾养殖业的基石，在世界各地提供了巨大的经济价值和优质蛋白质。然而，集约化养殖方式使得
• 制备并评估了针对TPV毒力蛋白的特异性纳米抗体。
• 从未免疫的羊驼和鲨鱼噬菌体文库中筛选了VHH和vNAR纳米抗体。
• 将选定的纳米抗体整合到试纸条中用于TPV的快速检测。
引言 凡纳滨对虾 是全球对虾养殖业的基石，在世界各地提供了巨大的经济价值和优质蛋白质。然而，集约化养殖方式使得该物种极易受到感染性疾病的侵袭[1]。半透明幼虾副溶血弧菌病（TPV）是一种新出现的对虾疾病，对对虾养殖业构成了严重威胁[2]。该病毒力极强，感染的对虾表现出严重的临床症状，主要表现为淡色的萎缩肝胰腺和空白的消化道，从而呈现出特征性的半透明外观[3]，[4]。TPV的高致死性是由一个187-kb的毒力质粒驱动的，该质粒编码三种核心致病毒蛋白，包括VHVP-1、VHVP-2和VHVP-3[5]，[6]，[7]。这些蛋白共同构成了一个完整而强效的毒素系统，协同介导对宿主细胞的病理性损伤[3]。鉴于该质粒能够在弧菌属 内以高频进行接合转移的能力[8]，TPV可在养殖环境中迅速传播。由于TPV的发病机制高度依赖于这三种毒力因子的联合表达，因此它们是靶向病原体监测的理想且特异性生物标志物。因此，在缺乏有效治疗措施的情况下，建立快速准确的诊断策略对于疾病的早期管理和减少经济损失至关重要。
目前TPV的诊断策略主要依赖于靶向主要毒力因子的常规PCR和实时定量PCR（qPCR）[9]，通常辅以组织病理学和微生物学确认感染[4]，[10]。尽管这些诊断方法具有极高的敏感性和特异性，但其高昂的费用和对专业人员的依赖使其难以满足对虾养殖中即时现场检测的需求。因此，越来越多的努力被投入到开发和便携式生物传感策略的开发中，以便在资源有限和现场条件下实现及时检测[11]。为了克服这些局限性，基于特异性抗原-抗体反应的胶体金免疫层析试纸条提供了一种极具优势的选择，该技术已被广泛应用于水产疾病诊断[12]。免疫层析平台也日益被开发用于快速和便携式检测，其优势在于操作简单和可视化信号读出，特别适合现场应用[13]。然而，对传统单克隆或多克隆抗体的依赖——这些抗体分子量大、批次间变异大且生产成本高——可能会显著损害这些检测方法的重复性和敏感性。因此，寻找具有高亲和力和特异性的成本效益型抗体对于开发高敏感性和可重复的现场诊断工具至关重要。
在抗体工程领域，单域抗体（通常称为纳米抗体，Nbs）已成为一种非常有效的诊断工具。它们的分子量仅12至15 kDa[14]，保留了常规抗体的完整抗原结合能力，同时是已知最小的天然抗原结合片段。这些纳米抗体来源于骆驼科动物重链抗体的可变域（VHHs）和软骨鲨鱼的IgNAR（vNARs）[15]，[16]，[17]，这些独特分子天然不含轻链。这两种纳米抗体在拓扑结构上存在显著差异。具体来说，VHH利用三个互补决定区（CDR），而vNAR主要依赖于延长的CDR3以及高度多变的环结构[18]。尽管存在这些结构差异，这两种分子都利用其延长的CDR3穿透传统IgG抗体无法接近的隐蔽抗原表位[17]，[19]。此外，它们紧凑的特性使它们非常适合在大肠杆菌 等原核宿主中进行高产、经济的重组生产[20]。这种易于遗传工程的特性不仅显著降低了生产成本，还确保了批次间变异的极小化。由于这些独特优势，纳米抗体已在多个领域引起广泛关注，包括医学成像[21]、疾病治疗[22]以及体外诊断[23]。虽然近期研究已成功利用该技术为传染性皮下和造血组织坏死病毒（IHHNV）和急性肝胰腺坏死病（AHPND）等重要水产病原体开发了胶体金免疫层析试纸条[24]，[25]，但基于纳米抗体的TPV检测仍然缺乏。
为了开发TPV的快速诊断工具，我们的研究最初聚焦于从其主要毒力蛋白（包括VHVP-1、VHVP-2和VHVP-3）中筛选高免疫原性表位（图1）。通过采用噬菌体展示技术，我们从未免疫的骆驼和鲨鱼文库中成功分离了特异性VHH和vNAR结合分子。在全面评估它们的结合机制和亲和力后，我们将表现最佳的纳米抗体候选分子整合到胶体金免疫层析试纸条中。本研究为TPV的快速现场鉴定奠定了基础。
章节摘要 VHVP蛋白表位的生物信息学预测 从GenBank数据库中检索了TPV主要毒力因子VHVP-1（GenBank登录号：WP_269169668.1）、VHVP-2（GenBank登录号：
APX09935.1 ）和VHVP-3（GenBank登录号：KIT24301.1）的氨基酸序列。使用ProtParam在线工具分析了它们的理化性质。利用ProtScale分析了它们的亲水性和疏水性特征。采用TMHMM 2.0服务器预测了跨膜结构域的存在，而SignalP 5.0
VHVP抗原表位的生物信息学筛选 基于对TPV主要毒力蛋白VHVP-1、VHVP-2和VHVP-3的生物信息学分析，成功筛选出了高免疫原性抗原表位片段。由于这些毒力蛋白的分子量较大（VHVP-1：283.37 kDa；VHVP-2：161.34 kDa；VHVP-3：106.6 kDa），因此考虑了截短处理。首先，通过理化性质和亲水性/疏水性分析排除了高度疏水区域（图2A、D和G），并对大量候选分子
讨论 TPV的快速准确检测对于有效的疾病监测至关重要。基于抗原-抗体反应的胶体金免疫层析试纸条为水产病原体监测提供了一种简单快速的检测平台[26]，[27]。纳米抗体具有稳定性高、生产效率高和易于纯化等优势，使其成为免疫分析中有前景的识别元件[28]。在本研究中，从
结论 在本研究中，我们通过分离针对TPV主要毒力因子VHVP-1、VHVP-2和VHVP-3的特异性纳米抗体（VHH和vNAR），成功开发了TPV的快速诊断平台。这些纳米抗体表现出良好的结合亲和力（EC50 ：2.084–46.03 ng/μL，K D ：50.5–724 nM），体外试验和分子对接结果均证实了这一点。利用这些纳米抗体，我们制备了胶体金免疫层析试纸条，能够检测到目标抗原
研究局限性 虽然本研究展示了纳米抗体在对虾病原体检测中的应用潜力，但仍需承认一些局限性。首先，目前的体内试验仅作为概念验证，使用的是有限数量的成年虾样本。由于未评估高度敏感的幼虾阶段，未来针对幼虾阶段的大规模田间评估对于建立真正的诊断敏感性和现场适用性至关重要。其次，检测限
CRediT作者贡献声明 庄桂林： 撰写——初稿、软件、方法论、调查研究、数据整理。邵硕茹： 项目管理、调查研究。杨浩然： 调查研究。刘妮娜： 调查研究。王梦强： 撰写——审阅与编辑、指导、调查研究、资金获取、概念设计。
利益冲突声明 作者声明，本研究是在不存在任何可被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢 本研究得到海南省自然科学基金重点项目 （326ZD1012）的资助。
庄桂林|邵硕茹|杨浩然|刘妮娜|王梦强
