从分子差异到材料性能：通过KAP与IFP的分级分离提升羊毛角蛋白膜性能

《International Journal of Biological Macromolecules》：From molecular disparity to material performance: Enhancing wool keratin film properties by hierarchical separation of KAPs and IFPs

　　

• •
  本报告提出了一种两步分级提取策略，可成功从羊毛纤维中分离出高纯度的KAPs（角蛋白酸性蛋白）和IFPs（中间丝蛋白）。
• •
  KAPs与IFPs各自独特的结构分子架构决定了它们的溶解动力学、聚集行为以及成膜能力。
• •
  富含IFP的材料在无需外加增塑剂或交联剂的情况下，即表现出优异的溶液稳定性和成膜均匀性。

引言

羊毛角蛋白是一种天然存在、储量丰富、可生物降解且具有高度生物相容性的聚合物材料 [1]、[2]，在可再生塑料、伤口愈合以及组织工程修复等领域具有显著的应用潜力 [3]、[4]、[5]。然而，与自然羊毛纤维相比，再生角蛋白材料表现出显著较差的力学性能，具有高脆性和低韧性。这一局限阻碍了其被直接加工成稳定的薄膜或连续纤维，从而妨碍了实际应用和规模化发展。这种性能下降主要归因于溶解和再生过程中分子聚集缺乏控制，破坏了天然层级结构的重建，并在多个尺度上削弱了结构完整性。

天然羊毛纤维卓越的力学性能源于其层级有序、多尺度的结构——最显著的便是纳米级"中间丝–基质"结构。由I型和II型角蛋白组成的IFPs通过α-螺旋卷曲螺旋基序自组装成刚性的纳米纤维支架；相比之下，KAPs则充当交联基质，凭借高密度的二硫键将IFPs整合成一个内聚的、承载力的纳米纤维网络 [6]、[7]、[8]。要将不溶的羊毛纤维转化为可加工的再生材料，必须破坏共价二硫桥和非共价相互作用（氢键及离子/静电作用），从而在合适的溶剂体系中实现完全的链解缠和均质溶剂化。然而，一旦去除还原环境，释放出的巯基、带电残基和极性侧链便会发生非特异性重组，导致二硫键、离子键和氢键随机重新形成。这阻碍了对IFPs与KAPs之间天然空间组织和功能分区的忠实重建，最终损害结构保真度，并导致再生材料在拉伸强度、断裂伸长率和尺寸稳定性方面严重下降 [9]、[10]。

目前，羊毛角蛋白提取方法主要包括化学方法（还原法、氧化法 [11]、[12] 以及离子液体法）、物理方法（如沸水法和闪爆法）和酶法 [13]、[14]、[15]、[16]、[17]。其中，还原法（使用还原剂和高浓度尿素或硫脲）在高提取效率与相对完整保留角蛋白分子链之间实现了良好平衡，同时能高效地重新形成二硫键；因此特别适用于制备高性能角蛋白基材料 [10]、[15]。在通过还原法提取羊毛得到的再生角蛋白体系中，IFPs和KAPs以混合组分形式存在，且它们的分子结构存在本质差异。已有报道指出，IFPs的分子量高且含硫量低（>45 kDa，半胱氨酸含量3–6.5%），而KAPs的分子量低且含硫量高（10–35 kDa，半胱氨酸含量11%–38%）[6]。这些组分的结构差异导致再生过程中角蛋白容易发生无序聚集，最终形成絮状沉淀，严重影响再生角蛋白的溶液稳定性，并阻碍后续成型过程中有序结构的构建。

IFPs因其高分子量和自组装形成延展性纳米纤维网络的能力，被广泛认为是高性能角蛋白基材料的结构基石 [20]、[21]。在此基础上，Ng Kee Woei等人成功地使用从人类头发中分离的富集IFPs制备了多种生物材料，包括纳米纤维、膜、水凝胶和海绵 [18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。类似地，Luca Cera等人采用还原提取方案，从安哥拉羊毛中获得了超高分子量角蛋白（≈150 kDa）；随后通过粒子诱导自组装获得了高浓度的向列型液晶相（401.7 mg·mL^?1），从而制备出力学性能强健的再生角蛋白纤维和刺激响应型形状记忆薄膜 [9]。相比之下，KAPs由于在标准再生条件下表现出显著的不可逆聚集和沉淀倾向，在传统加工过程中往往被去除。据报道，KAPs具有富含甘氨酸（赋予构象塑性）、酪氨酸（实现强π–π和氢键相互作用）和半胱氨酸（作为动态二硫交联位点）的不同结构域，这些结构域共同调节着角蛋白基材料的拉伸强度、韧性和弹性恢复 [23]。关于KAPs缺乏症的临床研究——例如三联体营养不良——进一步证实了这一作用：KAPs表达降低会减少可用于链间二硫键形成的半胱氨酸残基密度，直接损害纤维内聚性，导致毛发极度脆性化和力学失效 [7]。

然而，目前对于IFPs和KAPs在"结构–溶解–再生–成膜"整个流程链中缺乏系统性和比较性研究，这使得从组分原始层面厘清再生角蛋白材料力学性能下降的内在机理变得困难。因此，深入研究IFPs和KAPs在分子结构、溶解度和成膜性能方面的根本差异，对于理解再生角蛋白材料性能差的根本原因具有重要意义。在此，我们采用两步策略从羊毛中分级提取KAPs和IFPs组分。通过多尺度结构表征，我们系统地表征和比较了KAPs与IFPs在分子量分布（SDS-PAGE）、二级结构（FTIR）、结晶度（XRD）、氨基酸组成以及巯基/二硫键含量等关键结构参数上的差异。在此基础上，我们对KAPs和IFPs在再生过程中的溶解、聚集和成膜行为进行了系统研究。我们阐明了两者组分开差异如何决定再生角蛋白材料的宏观性能，为高性能再生角蛋白材料的设计提供了理论基础和可行路径。

章节摘要

材料与试剂

羊毛纤维（市售预梳美利奴羊毛条，60 s）由谢信毛纺织有限公司（中国无锡）提供。尿素、二硫苏糖醇（DTT）和硫脲购自江科源（中国北京）。乙醇购自国药集团（中国上海）。

KAPs、IFPs和总角蛋白（TK）的提取

KAPs和IFPs通过此前所述的顺序提取方案从羊毛纤维中提取 [21]、[22]。KAPs提取：将切碎后的羊毛纤维（2–3 mm）在KAPs提取液中以50 °C孵育72 h

分子量分布

采用SDS-PAGE分析来验证KAPs的选择性提取，通过监测所提取蛋白的分子量分布。文献已充分记载，使用传统变性剂/还原剂组合提取的角蛋白在SDS-PAGE中通常呈现10–30 kDa的条带（归属于KAPs）以及45和55 kDa的条带（对应于I型和II型角蛋白，即IFPs）[13]、[15]。I型（酸性，pI 4.5–5.5）和II型（碱性，pI 6.5–7.5）角蛋白

结论

本研究采用两步分级提取策略，从羊毛中分离并富集了KAPs和IFPs。系统研究表明两种蛋白组分之间存在根本差异。KAPs表现出较低的分子量（10–28 kDa）、较高的SS含量（总SH为1.56 ± 0.07 mmol/g）以及以β-折叠为主的构象。IFPs在45–100 kDa范围内呈现特征条带，相对较低的SS含量（总SH为1.02 mmol/g），并以占主导的

CRediT作者贡献声明

张楠（Nan Zhang）：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿撰写，监督指导，资源提供，项目管理，方法论，经费获取，概念构思。尤娜（Na You）：可视化，软件，方法论，调查研究，形式化分析，数据管理。王琦薇（Qiwei Wang）：方法论，调查研究，形式化分析，数据管理。龚磊（Lei Gong）：写作 – 审阅与编辑，资源提供，经费获取，概念构思。王源（Yuan Wang）：项目管理，方法论，调查研究。纪俊玲（Junling Ji）：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能对本文所报告的工作产生影响。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（52303004，22208030）、纺织行业丝产品医卫应用重点实验室开放项目（SDHY2233）、常州大学科研启动基金项目（ZMF23020026）的资助。

Nan Zhang|Na You|Qiwei Wang|Lei Gong|Yuan Wang|Junling Ji