《NAR Genomics and Bioinformatics》：Customizable host and viral transcript enrichment using CRISPR–Cas9 long-read sequencing for characterization of low-to-moderate abundance isoforms
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全转录组测序的主要挑战之一是难以检测和定量低至中等丰度的转录本。解决此问题的现有方法要么难以规模化或定制化；长程PCR难以扩展，而探针杂交面板则定制成本高昂。在本研究中，研究人员开发了一种基于RNA引导的CRISPR-Cas9核酸内切酶富集策略，并结合了长读长
全转录组测序的主要挑战之一是难以检测和定量低至中等丰度的转录本。解决此问题的现有方法要么难以规模化或定制化；长程PCR难以扩展，而探针杂交面板则定制成本高昂。在本研究中，研究人员开发了一种基于RNA引导的CRISPR-Cas9核酸内切酶富集策略，并结合了长读长测序，实现了对目标高达60倍的富集。研究结果表明，CRISPR-Cas系统是一种高度有效的、可定制的目标转录本长读长测序方法，并且能够保留对相对丰度的评估。
论文解读文章
研究背景与科学问题
在真核细胞中，单个基因可通过可变转录起始、剪接、内含子保留和多聚腺苷酸化等过程产生多种信使RNA（mRNA）产物。在人类中，约95%的蛋白质编码基因会发生不同程度的可变剪接，每种异构体都包含独特的功能特征，从而影响蛋白质的产生，使转录组和蛋白质组多样化。转录本异构体的转换已在多种疾病和感染中被发现，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染。因此，不仅在基因水平，更在异构体水平上考察转录组多样性对于全面理解疾病发病机制至关重要。
长读长RNA测序已被广泛用于理解不同细胞类型的基因表达，解析全长转录本异构体及其他复杂的RNA加工事件。然而，这一过程通常涉及对整个转录组的测序，导致测序读数不成比例地分配给高表达的转录本。因此，低丰度的异构体由于每个转录本的覆盖度不足而经常被忽视。此外，许多诊断分析只需要关于一小部分转录本表达的信息。现有的靶向测序方法存在局限性：长程RT-PCR难以扩展到大型基因面板；基于杂交捕获的方法成本高昂且定制不灵活。因此，亟需一种可定制、经济高效且易于实施的方法来富集特定转录本。
研究方法与技术路线
为解决上述问题，研究人员采用了一种名为纳米孔Cas9引导靶向测序（nCAT）的策略。该方法首先从A549和Caco-2细胞系（包括SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞）中提取总RNA，并使用poly(T)28引物合成双链cDNA。随后，针对目标基因设计并合成CRISPR RNAs（crRNAs），并与反式激活crRNA（tracrRNA）结合形成向导RNA（gRNA）。gRNA与HiFi Cas9核酸酶V3结合形成核糖核蛋白复合物（RNP），对去磷酸化的cDNA进行特异性切割，产生游离的5‘磷酸基团。最后，将测序接头连接到这些切割后的cDNA末端，使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）的MinION或GridION平台进行长读长测序。数据分析流程包括使用Dorado软件进行碱基识别，Minimap2进行序列比对，FeatureCounts和Salmon进行基因和异构体水平的定量。
研究结果
1. CRISPR-Cas9靶向测序对目标转录本的高效富集
研究人员首先选择了五个在A549细胞系中具有不同表达水平的人类基因（FTL, TMSB10, TMSB4X, GAPDH, ALDH1A1）进行验证。通过比较Cas9富集测序数据与之前发表的全转录组直接cDNA测序数据，发现该方法显著提高了所有目标转录本的覆盖度，平均目标映射覆盖度达到300×到2200×。超过50%的特征分配读数是靶向目标的，而在非富集测序中这一比例仅为约2%。其中，GAPDH基因的富集倍数最高（62倍），TMSB10最低（23倍）。进一步分析表明，脱靶读段主要是由随机连接引起的，而非Cas9的特异性切割错误。重要的是，富集后目标基因的表达水平与非富集全转录组测序的结果高度相关（Pearson相关系数为0.93）。
2. Cas9靶向测序增强目标信号用于异构体鉴定
为了测试该方法在异构体鉴定方面的能力，研究人员关注了具有已知异构体的KPNA2基因。该基因的两个主要异构体KPNA2-201和KPNA2-202在长度上存在差异。通过设计一个结合在第二个外显子的gRNA，Cas9靶向测序成功地将KPNA2的覆盖度平均提高了62倍。定量分析显示，KPNA2-201在两个细胞系中均占主导地位，且两种异构体的相对比例在富集和非富集方法中得到保持。更重要的是，该方法能够检测到在全转录组cDNA测序和直接RNA测序（dRNA-seq）中很少见的、覆盖KPNA2-202第一个外显子的读段。
3. 富集SARS-CoV-2 RNA改善了受感染细胞中多种病毒亚基因组的鉴定
研究人员将Cas9富集策略应用于SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞。通过设计一个靶向病毒5’端前导序列的crRNA，成功捕获了所有可能的病毒结构蛋白和附属蛋白的亚基因组RNA（sgRNA）。结果显示，在24小时感染时间点，富集后病毒读段的比例从非富集时的2%显著提升至超过40%（20倍增加）。该方法覆盖了整个SARS-CoV-2基因组，并清晰地展现了每个开放阅读框（ORF）的均匀覆盖，符合SARS-CoV-2的不连续转录模型。所有在非富集测序中发现的sgRNA均在富集样本中被检测到，且其表达模式（如核衣壳蛋白N表达最高）与非富集数据高度一致。
研究总结与意义
研究人员在讨论中指出，Cas9靶向测序（nCAT）作为一种PCR-free的方法，只需最少数量的gRNA即可实现对目标转录本的有效富集，相比依赖大量生物素化捕获探针的TEQUILA-seq等方法更为简便和经济。该方法不仅适用于人类转录本，也能有效富集来自病毒的转录本，为研究病毒-宿主相互作用提供了有力工具。尽管该方法存在一些局限性，例如需要较高量的起始cDNA输入、产生的平均读长略短于全长测序，以及在处理未知结构的转录本时可能需要优化gRNA设计，但其优势明显。研究表明，Cas9切割效率与富集倍数呈正相关，通过建模可以很好地预测原始样本中的转录本丰度（平方相关系数达0.98）。最终，研究人员得出结论：Cas9靶向测序能够实现复杂转录组中特定转录本的可定制富集，为聚焦性发现和定量转录本异构体提供了一个稳健的工具。该方法有望因其成本效益和简便的操作流程，在多样化的生物医学和临床环境中得到广泛应用。
