基于Amastin的抗利什曼病多表位疫苗候选物的计算设计、结构建模及免疫评估

《Human Immunology》：Computational design, structural modeling and immune evaluation of an amastin-based multi-epitope vaccine candidate against leishmaniasis

　　

摘要

利什曼病是由利什曼属原虫寄生虫引起的一种被忽视的热带疾病。目前尚无获批的人类疫苗可用，且日益增长的耐药性持续威胁着疾病控制。本研究旨在通过综合免疫信息学方法，计算设计并评估一种针对杜氏利什曼原虫（UniProt ID: A5XDA6）保守阿米巴蛋白的多表位疫苗候选品。我们预测并依次筛选了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、辅助T淋巴细胞（HTL）和B细胞表位，筛选依据包括HLA结合亲和力、抗原性、致敏性和与其各自HLA分子的分子对接。最终共选择了12个表位（5个CTL、4个HTL和3个B细胞表位）。保守性分析表明，大多数表位在杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫和大麻利什曼原虫中高度保守，而人群覆盖分析预测全球覆盖率为81.61%。所选表位通过AAY、GPGPG和KK连接肽组装为209个氨基酸的疫苗构建体，并以TLR4激动剂RS-09作为佐剂。预测该构建体具有抗原性、非致敏性、稳定性和可溶性，结构验证确认了高质量的三维模型。分子对接表明其与TLR4受体具有良好相互作用，而不连续B细胞表位分析揭示了疫苗构建体与原阿米巴蛋白之间的结构相似性。正常模式分析、分子动力学模拟和免疫模拟进一步支持了疫苗构建体的结构稳定性和免疫原性潜力。100 ns分子动力学模拟确认了疫苗-TLR4复合物的结构稳定性，MM/PBSA和MM/GBSA结合自由能分析进一步支持了疫苗构建体与TLR4之间的良好结合亲和力。密码子优化和体外克隆表明在Escherichia coli pET-28a (+)表达系统中表达良好。这些计算结果表明，所提出的多表位疫苗是一种有前景的候选品，需要进一步实验验证才能实现其作为利什曼病疫苗的功效。

引言

利什曼病是一种由利什曼属原虫寄生虫引起的媒介传播性被忽视热带疾病。该病会导致皮肤溃疡，在严重情况下会影响内脏器官并具有致命威胁。该病在98多个国家流行，主要表现为皮肤利什曼病（CL）或内脏利什曼病（VL）。CL进一步分为皮肤型、黏膜皮肤型和弥散型[1]。每年CL影响60万至100万人，主要分布在美洲、地中海地区、中东和中亚。VL每年导致5万至9万例病例，主要分布在巴西、东非和印度[2]。传播途径为受感染雌性白蛉叮咬，贫困、营养不良、人口迁移和卫生条件差等因素会增加患病风险。CL由热带利什曼原虫、犬热利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫、墨西哥利什曼原虫、圭亚那利什曼原虫、巴西利什曼原虫和巴拿马利什曼原虫引起，而VL由杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫和恰加斯利什曼原虫引起。未经治疗的VL可导致严重贫血、免疫抑制和死亡[3]。

巨噬细胞是利什曼原虫的主要宿主。通过T细胞依赖机制，巨噬细胞在预防或促进该病中发挥重要作用。寄生虫会削弱巨噬细胞的杀伤功能，并触发T细胞释放IL-4和其他促进感染的因子[3]。化学治疗是主要治疗方法，包括两性霉素B、巴龙霉素和米替福新等药物。然而，耐药性正成为一个重大挑战[4]。印度消灭该病的努力因贫困、营养不良、耐药性、HIV共感染以及诊断和治疗黑热病后皮肤利什曼病（PKDL）的困难等因素而受到阻碍[5]。由于上述原因，疫苗被认为是最佳的长期解决方案。

第一代疫苗使用灭活或减毒活寄生虫。活疫苗可诱导强烈的免疫反应，但存在安全风险，尤其是在免疫功能低下的人群中[6]。灭活疫苗更安全但效果往往较差，且需要多剂次接种[7]。较新的灭活但代谢活性（KBMA）疫苗在临床前研究中显示出前景[8]。第二代疫苗是亚单位或重组疫苗，包括使用gp63、PSA-2、HASPB1和Leish-111f等特异性寄生虫抗原来产生定向且更安全的免疫反应[9]。第三代疫苗使用DNA或RNA指导宿主细胞产生寄生虫蛋白，提供稳定、低成本且可制造的选择，可同时刺激体液和细胞免疫[6]、[9]。但长期安全性和基因组整合仍是一个问题。然而，由于寄生虫生命周期复杂且能够通过靶向和抑制巨噬细胞、干扰关键信号通路以及寄生在宿主细胞内而逃避免疫系统[10]，因此尚无商业化疫苗。科学家们目前正在使用反向疫苗学等高级计算机模拟方法来加速研究进程。

反向疫苗学使用基因组数据和计算工具在不培养病原体的情况下设计疫苗。它识别对病原体存活至关重要的关键抗原或表位。这些表位随后通过体外或体内实验进行测试[11]。对于利什曼原虫，一些有前景的疫苗候选品已通过免疫信息学方法鉴定。热带利什曼原虫的多表位构建体显示出稳定的TLR4相互作用[12]，MHC-II类表位在小鼠中诱发了强烈的免疫反应[13]，一种嵌合杜氏利什曼原虫疫苗诱发了强烈的Th1反应[14]。计算工具可预测B和T细胞表位（IEDB、NetCTL、NetMHC、ProPred-II、Bepipred、Discotope）[15]，分子对接使用AutoDock和ClusPro等软件评估其与MHC分子的结合[15]、[16]。该方法使利什曼病疫苗开发更加快速简便。尽管取得了这些进展，但利什曼原虫疫苗候选品的开发仍然具有挑战性，原因包括寄生虫的复杂性、其抗原多样性以及疫苗需要同时诱导强效细胞和体液免疫反应的要求[17]、[18]。尽管已有几项基于免疫信息学的多表位疫苗研究报告了有前景的候选品，但抗原选择、表位优先排序策略和验证流程的差异导致所提出的疫苗构建体之间存在相当大的变异性[18]、[19]。因此，需要进一步的研究采用全面的计算评估和严格的表位筛选策略，以识别具有更广泛保护潜力的疫苗候选品。

本研究中，阿米巴蛋白被选为针对利什曼原虫的计算机模拟疫苗设计的目标抗原。阿米巴蛋白是一种跨膜糖蛋白，主要在内殖期（感染宿主巨噬细胞的阶段）表达。其表面暴露特性及其在利什曼原虫物种中的高表达使其成为强效疫苗靶点[20]。除了其生物学重要性外，阿米巴蛋白还是一种保守的表面糖蛋白，在巨噬细胞内的寄生虫存活和宿主-寄生虫相互作用中发挥重要作用。其膜定位和阶段特异性表达使其成为免疫信息学疫苗开发的理想抗原。临床重要利什曼原虫物种间观察到的高度序列保守性表明，阿米巴蛋白衍生的表位可能对更广泛的跨物种免疫保护有贡献[21]。在计算机模拟疫苗研究中，阿米巴蛋白已被确认为内脏利什曼病（VL）的潜在疫苗候选品，其前63个氨基酸包含特征基序，在小鼠中显示出高免疫原性和保护能力[22]。Zhang及其同事（2020）使用阿米巴蛋白联合KMP-11和GP63设计了计算机模拟多表位疫苗，在小鼠中显示出保护性免疫反应[23]。类似地，Saha及其同事（2022）使用阿米巴样表面蛋白开发了针对杜氏利什曼原虫的亚单位疫苗[24]。Dikhit和Sen（2023）也使用反向疫苗学鉴定阿米巴样蛋白为强抗原候选品[25]。此前，Rochette等人（2005）和Jackson等人（2009）强调了阿米巴蛋白的结构和免疫原性作用及其在寄生虫感染性中的重要性[20]、[26]。它还作为VL诊断的生物标志物[27]，并能诱导Th1型免疫反应，包括淋巴增殖和IFN-γ水平升高[28]。总之，这些发现表明阿米巴蛋白具有疫苗开发所需的多种特性，包括表面定位、免疫原潜力、临床重要利什曼原虫物种间的保守性以及参与宿主-寄生虫相互作用。这支持了本研究将其选为目标抗原的决定。

尽管已有几项针对利什曼原虫的基于免疫信息学的疫苗研究报告，但大多数研究要么聚焦于多种抗原，要么表位筛选标准有限，要么仅评估单一寄生虫物种。本研究提供了聚焦于杜氏利什曼原虫保守阿米巴蛋白的全面计算框架。与以往研究不同，所选CTL、HTL和B细胞表位通过基于HLA结合亲和力、抗原性、致敏性、与HLA分子的分子对接、人群覆盖率和跨物种保守性的顺序筛选进行优先排序。此外，还通过不连续B细胞表位与原生阿米巴蛋白的比较评估了设计疫苗构建体的结构模拟性。还进行了结构验证、免疫模拟、受体对接、分子动力学模拟和体外克隆。通过在单一工作流中整合这些互补分析，本研究提供了一个经过全面评估的疫苗候选品，具有对临床重要利什曼原虫物种提供广泛免疫覆盖的潜力，并为后续实验验证建立了坚实的计算基础。

章节摘要

材料与方法

本研究旨在通过综合免疫信息学方法识别和评估针对利什曼原虫的潜在多表位疫苗候选品。工作流程包括抗原选择、表位预测与优先排序、疫苗构建体设计、结构建模与验证、受体对接、分子动力学模拟、免疫模拟和体外克隆。

蛋白序列检索及选定蛋白抗原性和致敏性测定

目标蛋白的氨基酸序列成功从UniProt数据库以FASTA格式检索自杜氏利什曼原虫（UniProt ID: A5XDA6）。该序列包含183个氨基酸残基，并用于后续分析。阿米巴蛋白的抗原性预测值为0.7106。预测为非致敏性。

CTL和HTL表位预测

CTL表位使用NetMHC（ANN 4.0）服务器预测，而HTL表位使用NetMHC II（NN-align 2.3）识别。

讨论

利什曼病是一种影响全球数百万人的寄生虫病。根据世界卫生组织（WHO），利什曼病被认为是全球最被忽视的热带疾病之一[69]。尽管利什曼病是继疟疾之后第二常见的寄生虫病，但由于现有治疗方法有限、毒性较大且面临日益增长的耐药性，使其难以控制。这使得疫苗开发成为全球优先事项。不同类型的疫苗包括——

结论

本研究采用综合免疫信息学流程设计和评估了一种针对杜氏利什曼原虫保守阿米巴蛋白的多表位疫苗候选品。通过整合基于HLA结合亲和力、抗原性、致敏性、分子对接、人群覆盖率和跨物种保守性的顺序表位优先排序，成功开发了包含CTL、HTL和B细胞表位的疫苗构建体。设计的构建体表现出良好的——

CRediT作者贡献声明

Sonali Sharma：原始文稿撰写，调查研究。Preeti Sharma：审阅与编辑，指导，概念构思。Parvez Singh Slathia：审阅与编辑，指导，项目管理，方法学，概念构思。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

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