功能性ERAP2 rs2248374多态性对人原代表皮角质形成细胞HLA I类免疫肽组的影响

《Human Immunology》：Impact of the functional ERAP2 rs2248374 polymorphism on the HLA class I immunopeptidome in primary human epidermal keratinocytes

　　

摘要专业翻译 内质网氨基肽酶2（ERAP2）在内源性肽段装载至人类白细胞抗原（HLA）I类分子之前对其进行修剪。ERAP2基因中的一个常见多态性位点（rs2248374）可导致ERAP2 mRNA发生无义介导的衰变，进而造成蛋白表达缺失。该多态性与多种HLA I类相关炎症性疾病（包括银屑病）存在关联。 本研究旨在确定该特定多态性是否足以在人大原代表皮角质形成细胞（HEKs）中驱动HLA-C表达及HLA I类免疫肽组（immunopeptidome）的可测量差异。 研究人员对来自34名健康供体的HEKs进行了ERAP2（rs2248374）和HLA-C（rs4406273）基因分型。通过流式细胞术评估HLA-C表达水平。采用免疫亲和纯化法分离免疫肽组，并通过液相色谱–质谱联用（LC–MS）进行分析。 研究结果显示，在不同ERAP2基因型之间，HLA-C表达及整体免疫肽组特征（包括肽段产量、长度分布和氨基酸组成）具有可比性。然而，ERAP2基因型与肽段库（peptide repertoire）的差异相关，表现为基因型特异性肽段的存在；该效应在HLA-C06:02阳性供体中更为显著，在预测的HLA-C06:02多数投票结合肽段中则更为突出。在这一HLA-C*06:02分层背景下，P1锚定位置的序列和化学组成也出现了明显差异。这表明ERAP2的影响具有强烈的背景依赖性，并在异质性HLA环境中部分被掩盖。

论文解读

一、研究背景与意义

HLA I类分子表达于所有有核细胞表面，负责将细胞内来源的肽段呈递给CD8? T细胞，构成免疫监视的重要环节。这些肽段统称为免疫肽组，源自自身蛋白和细胞内病原体。对自身肽段的错误识别可能触发不当的免疫激活，被认为是免疫介导炎症性疾病启动的关键事件。免疫介导炎症性疾病具有复杂的多因素病因和强烈的遗传成分，其中特定HLA I类等位基因是多种疾病最强的遗传风险因素，如HLA-C*06:02与银屑病的关联。疾病风险还受到编码内质网氨基肽酶（ERAP1和/或ERAP2）基因变异的影响。ERAP1和ERAP2属于M1家族锌金属肽酶，负责修剪肽段前体的N端残基，以生成适合HLA I类结合的最佳长度肽段。ERAP1具有高度多态性，而ERAP2相对保守，但一个常见的单核苷酸多态性（SNP）rs2248374（A/G）发挥关键功能作用：A等位基因表达全长功能性ERAP2蛋白，G等位基因导致选择性剪接和无义介导的衰变。因此，GG基因型个体缺乏功能性ERAP2，AG杂合个体呈中间表达水平，AA个体表达正常水平。

在银屑病背景下，免疫肽组对于识别疾病相关的自身抗原尤为重要，例如由HLA-C*06:02呈递的黑色素细胞自身抗原ADAMTS样蛋白5（ADAMTSL5），其生成直接受ERAP1变异影响。近年来，基于液相色谱–质谱联用（LC–MS）的免疫肽组学研究已应用于银屑病相关模型，但多局限于细胞系和转基因系统，且主要聚焦于ERAP1。研究人员假设功能性ERAP2 rs2248374多态性会改变原代人角质形成细胞中HLA I类呈递肽段的库组成，并据此开展了系统比较研究。

二、主要技术方法

研究人员从丹麦奥胡斯AROS私立医院整形外科手术获得的剩余皮肤中分离人原代表皮角质形成细胞（HEKs），样本在接收前已匿名化处理，仅保留供体性别和年龄信息。共纳入34名健康供体。采用TaqMan预设计SNP基因分型检测对ERAP2 rs2248374和HLA-C06:02替代标记rs4406273进行基因分型。通过流式细胞术评估HLA-C表面表达。采用W6/32单克隆抗体（识别HLA-A、-B、-C共有单态结构）进行免疫亲和层析纯化HLA I类–肽段复合物，经低pH和高pH两步洗脱后，通过C18反相柱纯化肽段，最终使用Evosep Eno液相色谱系统耦联Sciex ZenoTOF 8600质谱仪，以数据非依赖性采集（DIA）模式进行分析。原始谱图在Spectronaut中采用MHC I类免疫肽工作流程处理，以人类蛋白质组为参考数据库，应用PSM/肽段FDR 0.01的质量阈值。肽段鉴定结果导出至R进行下游分析，并使用Immunolyser 2.0评估HLA-C06:02结合特异性。

三、研究结果

3.1 人口统计学特征与ERAP2基因型分布

研究共纳入34名健康供体，其中女性24人（71%），男性10人（29%），中位年龄40岁（范围22–62岁）。共有6名供体（18%）为HLA-C*06:02阳性。按ERAP2基因型分层（AA，n=13；AG，n=11；GG，n=10），各组年龄和性别分布相似。

3.2 HLA-C表达

在21个HEK培养物亚组中评估了IFN-γ对HLA-C表面表达的影响。IFN-γ刺激导致HLA-C细胞表面表达较未刺激条件显著增加（p=1.515×10??）。在IFN-γ刺激和未刺激条件下，不同ERAP2基因型之间的HLA-C表面表达均无统计学显著差异（IFN-γ刺激，p=0.098；未刺激，p=0.111）。配对分析显示，AA（p=0.036）和AG（p=0.008）基因型中IFN-γ诱导的HLA-C上调具有统计学显著性，而GG基因型未达显著水平（p=0.106），提示个体IFN-γ反应性因ERAP2基因型而异，尽管总体HLA-C表达水平不受影响。

3.3 HLA I类结合免疫肽组

通过免疫亲和纯化成功分离HLA I类–肽段复合物，并在肽段分离前通过Western blot确认。

3.4 不同ERAP2基因型的整体免疫肽组特征

全部34个样本中共鉴定出54,595条肽段，经8–14个氨基酸长度过滤后得到51,858条肽段。不同基因型组间每供体平均鉴定肽段数略有差异（AA：1685；GG：1600；AG：1267），但未达统计学显著性（p=0.10）。肽段长度分布在各基因型间具有可比性。9-mer肽段的序列标志图未显示基因型特异性基序，反映了供体HLA背景的异质性，但P2和P9锚定位点的保守性明显，符合HLA I类结合偏好。鉴于ERAP2的N端修剪活性，后续分析聚焦于9-mer肽段P1位置的氨基酸组成和化学性质。P1氨基酸和化学类别组成在各基因型间具有可比性。

进一步分析肽段库差异发现，三个基因型组共鉴定出6176条独特肽段序列，其中3225条（52.2%）为三种基因型共有；AA与GG间共享951条（15.4%），AA与AG间共享434条（7%），AG与GG间共享296条（4.8%）。基因型特异性肽段方面，536条（8.7%）仅在AA中检测到，223条（3.6%）仅在AG中检测到，511条（8.2%）仅在GG中检测到。对50条最频繁检测肽段的相对丰度分析显示，基因型水平上AG呈现与AA和GG不同的独特谱型，而AA与GG更为相似；但在个体供体水平上，各基因型组内存在个体间变异，未出现清晰的基因型驱动聚类。

3.5 基因型特异性肽段的特征

基因型特异性肽段数量在各基因型间呈非显著性趋势（p=0.077），AA中位数最高（71），其次为GG（63）和AG（21）。长度分布总体可比，但GG的13-mer肽段比例显著高于AA和AG（p=0.0023）。在9-mer肽段的P1位置，精氨酸（R）在所有基因型间差异显著（p=0.0007），GG中最高；缬氨酸（V）在AA与AG和GG之间差异显著（p=0.0001）。P1位置的化学性质分析显示，GG基因型中碱性残基显著富集（p=0.0041）。

3.6 HLA-C06:02阳性HEKs中按ERAP2基因型分层的免疫肽组特征*

在仅限于HLA-C06:02阳性供体的探索性亚分析中，比较了ERAP2 AA（n=3）和GG（n=3）基因型（无AG供体为HLA-C06:02阳性）。共鉴定9548条肽段，AA（1367）和GG（1337）每供体肽段中位数相似，长度分布亦相似。P1分析显示AA中丙氨酸（A）呈非显著性增高趋势（p=0.2752），GG中谷氨酸（E）显著富集（p=0.0495）。与此一致，AA中疏水性残基呈增高趋势，GG中酸性残基呈增高趋势（均p=0.0495）。AA与GG间独特肽段重叠率为49.7%，低于全队列观察值。基因型特异性肽段在两组中均存在（AA中26.3%，GG中24.0%）。50条最丰富肽段的丰度分析在个体样本水平仅显示适度的基因型聚类倾向。

3.6.1 HLA-C06:02预测结合肽段分析*

利用Immunolyser 2.0进行HLA-C06:02结合亲和力预测，9548条肽段中有2806条（29.4%）被分类为HLA-C06:02多数投票结合肽段。AA（440）和GG（516）每供体肽段中位数相似，长度分布亦相似。P1分析显示GG中谷氨酸（E）显著富集（p=0.0495），而异亮氨酸（I）和缬氨酸（V）在AA中富集（均p=0.0495）。与此一致，AA中疏水性残基倾向较高，GG中酸性残基倾向较高（均p=0.0495）。AA与GG间独特肽段重叠率为38.4%，低于未过滤的HLA-C06:02阳性队列中的49.7%，表明排除非HLA-C06:02肽段后基因型特异性差异更加明显。基因型特异性肽段在两组中均存在（AA中28.2%，GG中33.3%）。个体供体水平的丰度分析仅显示适度的基因型聚类倾向。

四、讨论与结论

研究成功分离并表征了原代HEKs中HLA I类结合的免疫肽组，提供了捕捉抗原呈递生物学变异的数据集。研究结果表明，在遗传异质性队列中，该单一多态性本身不足以产生主导效应，未观察到与HLA-C06:02或HLA-B27等强HLA I类风险等位基因相当的单基因座效应。然而，研究仍鉴定了基因型相关的差异，为理解ERAP2在抗原呈递中的作用提供了进一步见解。

不同ERAP2基因型间，肽段产量、长度分布和氨基酸组成等整体免疫肽组特征基本保守。但存在基因型特异性肽段，且共享肽段的相对丰度呈现独特模式。将分析限制于HLA-C06:02阳性供体后，基因型特异性肽段比例较全队列更高，进一步限制于预测的HLA-C06:02结合肽段后效应更为增强。这表明ERAP2的影响具有强烈的背景依赖性，在异质性HLA环境中部分被掩盖，与既往报道的ERAP2与HLA等位基因间的上位性相互作用一致。

机制层面，肽段长度分布无差异以及锚定位点（P2和P9）氨基酸偏好保守符合HLA I类结合偏好，支持数据集的真实性。尽管ERAP2参与肽段修剪，但各基因型间鉴定肽段总数无差异，可能反映了ERAP1的功能补偿，两种酶具有互补的底物偏好并可协同作用。ERAP1优先修剪较长肽段，而ERAP2偏好较短底物和带正电荷残基。与整体特征不同，ERAP2基因型影响肽段库，存在基因型特异性肽段。AG基因型表现出较少的基因型特异性肽段，可能反映其中等的ERAP2表达和酶活性，导致其肽段库与AA和GG均有重叠。P1位置的差异进一步支持ERAP2介导的修剪作用：ERAP2缺失时碱性残基富集，ERAP2表达时向疏水性和极性残基偏移，这与ERAP2已知的N端修剪活性一致。

研究优势在于使用原代人角质形成细胞提供生理相关模型，高分辨率LC–MS实现了大规模多样化免疫肽组的鉴定。局限性包括队列规模有限（尤其HLA-C*06:02亚组）、各供体具体HLA-A、-B、-C基因型未知、W6/32抗体捕获的免疫肽组反映三个位点的集体呈递、未评估ERAP1单倍型及其他功能性ERAP2 SNP、健康供体来源的角质形成细胞未捕捉疾病相关炎症状态。

未来研究应纳入更大队列并明确HLA和ERAP单倍型，采用匹配供体系中的选择性ERAP2抑制实验，可在相同HLA背景和ERAP1同种异型下直接评估ERAP2对抗原呈递的影响，为理解抗原加工酶如何塑造肽段选择和呈递强度提供更深入的机制见解。