《Nucleic Acids Research》：Type III CRISPR–Cas systems preferentially acquire spacers from early-expressed phage genes in a transcription-dependent manner
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CRISPR–Cas免疫依赖于获取spacer以产生功能性CRISPR RNA（crRNA）向导。对大多数RNA靶向的III型（type III）系统而言存在一个悖论：spacer从DNA捕获，但防御需要RNA互作，因此系统必须从DNA片段推断其转录相关性。研
CRISPR–Cas免疫依赖于获取spacer以产生功能性CRISPR RNA（crRNA）向导。对大多数RNA靶向的III型（type III）系统而言存在一个悖论：spacer从DNA捕获，但防御需要RNA互作，因此系统必须从DNA片段推断其转录相关性。研究人员比较了嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）在裂解性噬菌体感染期间共存的III型（RNA识别）与II型（DNA识别）系统的spacer获取谱。III型spacer获取高度富集于早期噬菌体基因，而II型spacer全基因组分布。高通量spacer测序显示，III型早期基因偏向在适应（adaptation）阶段产生，不依赖干扰（interference），并在保守的早期噬菌体启动子下游达到峰值。该偏向也见于公开S. thermophilus基因组中的天然III型spacer。将早期噬菌体启动子及下游基因克隆至质粒可重建III型获取热点；破坏启动子突变消除热点，破坏翻译突变增强热点。因此，III-A适应优先取样与最早噬菌体转录程序相关的DNA，富集产生靶向早期噬菌体RNA的crRNA的spacer。
《Nucleic Acids Research》刊发的该项研究围绕RNA靶向III型CRISPR–Cas系统如何获得功能性spacer这一核心问题展开。研究背景方面，CRISPR–Cas系统是细菌和古菌的适应性免疫体系，通过从入侵的移动遗传元件（mobile genetic elements，MGE）获取短片段并整合为spacer，转录加工成crRNA，与Cas蛋白形成核糖核蛋白效应复合物（crRNP）执行干扰。DNA靶向系统可由PAM等机制保证spacer方向性与功能性；而III型系统靶标为RNA，spacer却主要来自DNA，存在“DNA捕获—RNA干扰”的错位，且裂解噬菌体早期基因表达快、感染周期短，非转录区域DNA不能产生有效RNA靶向spacer。尚不清楚III型适应是否及如何偏好功能性spacer。
研究人员以嗜热链球菌为模型，比较内源共存III型（CR2，type III-A）、II型（CR1、CR3，type II-A）及I-E（CR4）系统的天然spacer、实验室噬菌体不敏感突变体（bacteriophage insensitive mutant，BIM）spacer与群体水平新spacer，并结合质粒移植与启动子突变实验，证明III-A适应在适应阶段即优先取样早期噬菌体启动子下游转录区域，而非由生存选择或干扰时机塑造。
关键技术方法上，研究人员构建了715株S. thermophilus基因组与752个 Streptococcus噬菌体基因组的数据库；利用CRISPRCasTyper鉴定系统与阵列；以CAPTURE高通量spacer测序分析感染小鼠相关菌株后阵列扩张；分离并测序噬菌体2972攻击后的BIM；通过同源重组构建Δcsm1-6缺失株消除III型干扰；将噬菌体2972早期启动子与ORF31克隆入pTRK882并在Δcsm1-6中转化，以床工具（bedtools）定量热点；用牛津纳米孔测序确认cos噬菌体末端。
Natural type III CRISPR spacers are uniquely enriched for early phage genes
研究人员分析715个S. thermophilus基因组中的1788个CRISPR–Cas系统，发现type III-A（CR2）阵列更短、spacer更长且变异大；将spacer比对至752个噬菌体基因组构成的元基因组后，III型spacer强烈富集于早期表达基因，并偏向噬菌体元基因组负链，该链可结合mRNA以执行RNA干扰；II型与I-E系统则按各自PAM（protospacer adjacent motif）在正负链较均衡分布，III型protospacer无典型PAM。
Spacers of laboratory-generated type III-A BIMs are enriched over early phage genes, and this bias is not explained by survival or growth bias
研究人员用移植JIM8232 III型系统的DGCC7710株经噬菌体2972筛选BIM。II型BIM的spacer遍布基因组；III型BIM的spacer绝大多数靶向早期基因，其中ORF31（编码cro样抑制蛋白）被25个BIM靶向，且几乎全为负链spacer。生长回染显示早、中、晚靶标BIM均完全抗噬菌体，说明早期富集不是生存或生长选择结果。II型BIM在高MOI下易出现PAM/seed区单核苷酸突变逃逸噬菌体；III型BIM极少逃逸，逃逸多为protospacer大片段缺失，表明III型更难被逃逸且早期偏向源于适应而非选择。
Type III spacer bias for early genes occurs during spacer capture
研究人员以MOI 100感染并用CAPTURE测序新spacer，发现III型新spacer在ORF31及下游早期基因形成热点，热点始于ORF31起始密码子后约10–50 bp；II型新spacer全基因组分布。Δcsm1-6缺失干扰后热点不变；早、中、晚靶标BIM中ORF31热点均存在。结果表明早期基因偏向在spacer捕获阶段决定，不依赖干扰时机与绝对转录丰度，也未发现引物式适应（primed adaptation）证据。
Type III preference for early transcribed genes is conserved across phages
研究人员在Δcsm1-6背景下用pac型噬菌体D3288与cos型噬菌体D6037、D5913感染，III型spacer均富集于早期cro样基因下游；纳米孔测序确认D5913的cos末端，但线性DNA末端并未成为III型spacer热点。结论为III型对早期启动子下游基因的偏好在不同包装类型噬菌体中保守，中期与晚期启动子无同等刺激作用。
Type III-A adaptation at the early-gene hotspot is transcription-dependent and driven by the early phage promoter
研究人员将噬菌体2972早期启动子与ORF31克隆至pTRK882转入Δcsm1-6，III型阵列出现与感染中一致的热点而II型无；破坏启动子消除热点，破坏翻译反而增强热点。证明该热点由早期噬菌体启动子驱动、具转录依赖性，翻译偶联不是必要正向信号。
讨论与结论部分总结：研究人员指出，天然与实验III型spacer均稳定偏好早期噬菌体基因，该现象由适应偏倚本身产生，而非BIM存活优势或生长差异。III-A系统通过优先采样最早转录程序对应的DNA，自动富集可生成靶向早期噬菌体RNA之crRNA的spacer，弥补了“从DNA取spacer却需RNA干扰”的固有矛盾。相较于II型依赖PAM与种子区、易被点突变逃逸，III型无PAM且要求转录关联，逃逸多需大缺失，因而在进化上更有利于维持对裂解噬菌体的早期防御。
研究结论翻译如下：III型CRISPR–Cas系统优先从早期表达的噬菌体基因获取spacer，这种偏向具有转录依赖性；其发生在适应阶段，由保守的早期噬菌体启动子驱动，且不依赖干扰。将早期启动子与下游基因移植至质粒可重建III型获取热点，破坏启动子消除热点，破坏翻译增强热点。因此，III-A适应优先取样支撑关键转录事件的DNA，富集可产生靶向早期噬菌体RNA的crRNA的spacer，使RNA靶向CRISPR–Cas系统在DNA来源材料中获得功能性免疫记忆。
