《Fish & Shellfish Immunology》：A Z-DNA/PKZ-based immunoenhancer confers protective immunity against GCRV infection in grass carp
编辑推荐：
•一种基于Z-DNA/PKZ的免疫增强剂能够激活I型干扰素（IFN）的先天免疫反应，提高血清IgM水平，并增强体液免疫反应。•该免疫增强剂在主要免疫和代谢器官（肝脏、肾脏、肠道、脾脏和鳃）中广泛分布，在体内的持久性可达20天，并显著提升抗氧化酶的活性。•在草鱼中，该免疫增强剂能将
- •
一种基于Z-DNA/PKZ的免疫增强剂能够激活I型干扰素（IFN）的先天免疫反应，提高血清IgM水平，并增强体液免疫反应。
- •
该免疫增强剂在主要免疫和代谢器官（肝脏、肾脏、肠道、脾脏和鳃）中广泛分布，在体内的持久性可达20天，并显著提升抗氧化酶的活性。
- •
在草鱼中，该免疫增强剂能将致命的GCRV病毒感染的相对存活率提高70%，为水產养殖中的病毒性疾病提供了一种有前景的宿主定向预防策略。
引言
草鱼（Ctenopharyngodon idella）是全球最重要的淡水养殖物种之一[1]。然而，集约化和高密度的养殖方式导致了传染病的爆发[2]。其中，由GCRV（草鱼呼肠孤病毒）引起的草鱼出血病尤其具有破坏性，幼鱼群体的死亡率可高达80%[3][4]。GCRV是最具致病性的水生呼肠孤病毒之一，它具有11段双链RNA（dsRNA）基因组，分为三种基因型（GCRV-I、GCRV-II和GCRV-III），其中GCRV-II在最近的疫情中最为普遍且毒性最强[5]。GCRV感染会导致草鱼大量死亡，给养殖业带来重大经济损失。
传统的养鱼疾病预防方法依赖于疫苗的开发，包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗[6][7][8][9]。灭活疫苗通过热处理或化学处理病原体制备，具有成本低廉和安全性的优点，但通常需要多次接种[10]。减毒活疫苗提供更强且更持久的免疫力，但存在恢复毒性的风险[11]。亚单位疫苗仅保留抗原蛋白，虽然安全，但通常需要佐剂或加强免疫才能达到保护效果[12][13]。核酸疫苗通过将抗原基因克隆到真核表达载体中，显示出诱导体液和细胞免疫反应的潜力[14][15][16]。然而，这些免疫预防措施大多针对单一病原体，其效果常常因病毒突变和进化而受到影响。由于GCRV是一种RNA病毒，其高度变异性常常削弱疫苗的保护效果。因此，开发能够增强宿主内在防御机制的广谱免疫增强剂是一个紧迫且具有商业前景的研究方向。
Z-DNA是一种左旋螺旋结构的DNA，与传统右旋的B-DNA不同[17]。在细胞内，Z-DNA可以在生理条件下产生，尤其是在嘌呤-嘧啶序列交替的区域，例如d(CG)n重复序列[18]。研究表明，病原体感染会诱导宿主细胞产生大量Z-DNA分子，从而激活免疫反应。具体机制是Z-DNA被多种细胞质Z-DNA结合蛋白识别，包括ZBP1（Z-DNA结合蛋白1）和ADAR1（腺苷脱氨酶作用于RNA 1），这些蛋白随后会触发哺乳动物的先天免疫反应[19][20][21]。识别到Z-DNA后，这些受体会激活下游信号通路，产生I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子，从而建立抗病毒状态[22][23]。在哺乳动物中，Z-DNA/ZBP1 axis具有免疫刺激潜力：ZBP1作为DNA疫苗佐剂，可增强CTL（细胞毒性T淋巴细胞）反应和抗肿瘤免疫[24]，而CBL0137可诱导Z-DNA激活ZBP1依赖性的凋亡，提高黑色素瘤的免疫治疗效果[25]。因此，Z-DNA是一种强有力的免疫刺激分子。
在鱼类中，Z-DNA可以被PKZ（蛋白质激酶Z）特异性识别，PKZ是一种仅存在于鱼类中的蛋白质激酶，最初是从稀有的鲦鱼（Gobiocypris rarus）中克隆出来的[26]。PKZ具有独特的N端Z-DNA结合结构域（Zα），该结构域包含两个亚结构域Zα1和Zα2，以及C端蛋白质激酶结构域[27][28]。因此，这种结构使PKZ能够作为细胞质中的Z-DNA识别受体发挥作用。PKZ特异性结合Z-DNA并上调I型干扰素的表达，而敲低PKZ则会抑制IFN的产生[28][29]。同时，PKZ的Zα结构域有助于Z-DNA的形成和稳定[30]。在哺乳动物中，Z-DNA传感器ZBP1通过激活IRF3来抑制人类巨细胞病毒（HCMV）感染，为开发抗病免疫增强剂提供了优秀的分子模型[31]。同样，鱼类PKZ也显示出作为抗病免疫增强剂的巨大潜力。
基于Z-DNA/PKZ作为免疫增强剂的潜力，本研究通过真核表达载体共同递送Z-DNA和PKZ，并评估了草鱼中的免疫反应，包括血清IgM水平、免疫相关基因表达、组织分布、抗氧化酶活性以及对GCRV感染的防护作用。本研究为开发水產养殖中的广谱免疫增强剂提供了理论基础。
章节片段
草鱼与病毒
健康体重在30-60克的草鱼（Ctenopharyngodon idella）来自中国南昌的南昌申农渔业公司。实验前，这些鱼在充气池中适应了14天，并每天喂食商业颗粒饲料。仅使用活力正常且无疾病症状的鱼进行实验。所有动物实验均获得南昌大学动物护理和使用委员会（IACUC批准号：NCUAUU-2022-563）的批准。
本研究中使用的GCRV-II菌株
重组质粒pCMV-Flag-GC和pCMV-Flag-PKZ的构建与验证
为了构建基于Z-DNA的免疫增强剂，将富含GC的Z-DNA序列和草鱼PKZ的全长编码序列分别克隆到pCMV-Flag载体中。通过PCR扩增验证了目标片段的插入情况，得到了预期大小的条带（GC约250 bp，PKZ约1500 bp）（图1A）。DNA测序进一步确认了正确的插入，产生的片段大小与预测一致（图1B），表明插入成功
讨论
由GCRV引起的草鱼出血病仍然是对草鱼养殖最严重的病毒威胁之一，尤其是在幼鱼中，目前的预防策略仍受病原体特异性、交叉保护能力有限以及实际应用中的挑战所限制。开发能够诱导广谱抗病毒保护的宿主定向免疫增强剂具有重要意义。在本研究中，我们构建并评估了一种新型
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究获得了南昌大学动物护理和使用委员会的批准（批准号：NCUAUU-2022-563）。
CRediT作者贡献声明
李梅峰：概念构思；方法学设计；实验实施；数据管理；数据分析；初稿撰写；项目统筹；资金争取。叶左成：概念构思；方法学设计；实验实施；数据管理；数据分析。毕彦珍：方法学设计；实验实施；数据管理；数据分析。徐晓文：概念构思；方法学设计；实验实施；数据管理；撰写与编辑；监督。
致谢
本项工作得到了国家自然科学基金（编号：32460928）、江西省自然科学基金（编号：20242BAB25396、20243BCE51118）以及江西省农业关键技术突破项目（编号：JXNK202605-03）的支持。
李梅峰|叶左成|毕彦珍|徐晓文
