《Food Chemistry: X》：Unveiling the patterns and mechanisms of time-specific release of multifunctional peptides from cricket protein
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Alcalase在时间特异性上决定了水解特性、肽谱和多功能性。抗氧化活性和血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性与结构展开相关的水解效率提升呈正相关。二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制活性更依赖于特定肽基序的特征。活性引导的多变量和差异肽谱分析揭示了候选肽。
Alcalase在时间特异性上决定了水解特性、肽谱和多功能性。抗氧化活性和血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性与结构展开相关的水解效率提升呈正相关。二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制活性更依赖于特定肽基序的特征。活性引导的多变量和差异肽谱分析揭示了候选肽。
全球人口持续增长加大了对可持续蛋白质的需求，食用昆虫因高饲料转化率和低碳排放而被视为传统动物蛋白的替代来源。蟋蟀蛋白（cricket protein, CP）蛋白质含量超过70%，氨基酸组成均衡，是产生生物活性肽的优良前体，但消费者接受度低且其多功能潜力尚未被充分挖掘。酶解可将昆虫加工成不易辨认的配料并释放具有抗氧化、降血压、降血糖等功能的肽段。然而，以往研究多采用水解终点的静态分析，忽视了蛋白质结构、水解特性和肽谱在水解过程中的时间演化，也未关注生物活性的动态变化。因此，研究人员以Alcalase为工具酶，对蟋蟀蛋白进行30–300分钟的时间序列水解，旨在解析时间特异性水解过程中结构变化、水解特性、肽谱及多种生物活性之间的关联，并筛选与各活性相关的候选肽。
研究人员将蟋蟀粉与去离子水按1:12（w/v）混合，调节pH至8.0，按蛋白含量加入5%（w/w）Alcalase，在55°C水浴中分别水解30、60、120、180、240和300分钟，制备了不同时间点的蟋蟀蛋白水解物（CPHs）。研究首先测定了水解度（DH）、蛋白回收率、分子量分布和氨基酸组成；采用UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS鉴定肽序列，结合PepOS流程进行肽组学分析；利用PeptideRanker预测潜在活性肽，通过ToxinPred预测毒性；运用两级偏最小二乘判别分析（PLS-DA）优先筛选时间特异性肽；再通过分子对接评估候选肽与靶蛋白的结合能力。同时，采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、游离及总巯基含量、表面疏水性和透射电子显微镜（TEM）动态监测水解过程中的结构变化。样本来源于云南明升农业科技发展有限公司提供的蟋蟀。
**3.1 水解特性、分子量分布和氨基酸组成的变化**
CPHs的DH随时间整体上升，300分钟达到最大值20.3%，60–240分钟出现平台期。蛋白回收率从30分钟的37.9%逐步升至300分钟的49.9%。分子量分布显示，<2 kDa的肽段在各时间点均占主导（88.0%–94.0%），且120分钟后<0.5 kDa的肽段超过60%。氨基酸组成中，谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸含量较高，疏水性氨基酸（259.7–332.1 mg/g）、芳香族氨基酸（35.7–46.6 mg/g）和含硫氨基酸（10.2–13.6 mg/g）在240和300分钟时达到最高。这些特征有利于肽段发挥生物活性。
**3.2 肽群体表征和活性预测**
鉴定到的肽段数量随水解时间从1072逐步增至1439。层次聚类热图和主成分分析显示不同水解时间点的肽组成存在显著差异，且肽的生成与降解持续进行。PeptideRanker评分>0.5的潜在活性肽数量从241增至343，预测功能主要涉及抗糖尿病（DPP-IV抑制）、抗高血压（ACE抑制）和抗氧化，表明蟋蟀蛋白是多功能肽的潜在前体。
**3.3 多功能活性肽的肽组学分析**
**3.3.1 DPP-IV抑制活性**
DPP-IV抑制活性呈双峰模式：30分钟21.6%升至60分钟35.2%，180分钟降至23.2%，240分钟回升至33.6%，300分钟又降至26.6%。序列分析显示，疏水性氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸）、甘氨酸和脯氨酸在肽段N端和C端的动态出现与活性变化相关。UpSet图显示不同时间点存在大量独特肽。探索性PLS-DA将SGPRLH和FAGPS优先关联至240分钟高活性样品，分子对接显示二者与DPP-IV的Glu 361、Glu 408、Ile 407等残基形成氢键和疏水相互作用，故被列为候选肽。
**3.3.2 ACE抑制活性**
ACE抑制率早期快速增长，30分钟约63.0%，随后趋于平缓，120分钟后持续上升，300分钟达峰值78.0%。肽段长度以2–6个氨基酸的短肽为主，且随时间延长数量增多。C端最后三个位置带正电荷氨基酸及脯氨酸的肽段特征与ACE抑制活性变化一致。UpSet图显示300分钟有107条独特序列。活动导向PLS-DA将SGLFDK、PAALGL、FAWQ、AEAFL等肽与300分钟高活性样品关联。分子对接显示这些肽均能良好结合ACE，其中SGLFDK与Arg 124、Glu 123、Arg 522等残基相互作用，PAALGL与Asn 66、Asp 121、Glu 123等残基结合，故被视为候选肽。
**3.3.3 抗氧化活性**
ABTS和DPPH自由基清除能力的IC??在30分钟时即达到最低（ABTS：0.180 mg/mL；DPPH：0.950 mg/mL），随后延长水解时间活性不再增强甚至下降。抗氧化肽候选序列中疏水氨基酸（丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸）和芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）比例较高，30分钟时芳香族氨基酸占比最高（24.0%）。UpSet图显示各时间点均有独特抗氧化肽，30分钟时独特肽为36条。PLS-DA将LYPL、VYGPL、NGAGGF等肽与30分钟样品关联。分子对接显示LYPL和VYGPL能与Keap1受体（PDB: 2FLU）的Asn 387、Ala 72、Leu 84等残基形成氢键，验证了其抗氧化潜力。
**3.4 酶解后蛋白质的结构特征**
**3.4.1 FTIR分析**
水解后酰胺I带从1657 cm?1移至1655 cm?1，酰胺II带从约1536 cm?1移至1547 cm?1，表明肽骨架局部化学环境改变。二级结构定量显示，α-螺旋+β-折叠比例从59.3%降至43.6%–49.0%，β-转角+无规卷曲从40.7%升至51.1%–56.5%，说明蛋白质从有序紧凑向柔性展开转变，且主要变化发生在水解早期。
**3.4.2 游离和总巯基含量**
F-SH和T-SH含量在0–120分钟快速上升，之后趋于稳定。结构展开暴露了包埋的半胱氨酸残基，同时水解可能切割二硫键，导致F-SH增加；T-SH表观增加源于展开后巯基与Ellman试剂可及性提高，而非真正的巯基净增加。
**3.4.3 表面疏水性（H?）**
水解后H?总体低于未水解CP（199.3 μmol g?1），且随水解时间延长呈下降趋势（120分钟例外）。低分子量肽段暴露的疏水基团减少，同时酶解产生的离子化氨基和羧基增强了分子极性，削弱了与ANS探针的结合。
**3.4.4 TEM分析**
未水解CP呈致密不规则块状聚集体。随着水解进行，大块逐渐崩解为细小均匀颗粒，120分钟后两亲性肽自组装成类似胶束的结构，疏水核心内埋。300分钟时形成相互连接的聚集网络，对应了二级结构比例和巯基含量趋于平台期的现象。
**3.5 功能特性与结构特性的相关性**
DH与ABTS、DPPH自由基清除能力和ACE抑制率呈正相关。α-螺旋和β-折叠含量与抗氧化和ACE抑制负相关，β-转角含量与二者正相关，表明结构柔性化有利于这些活性。T-SH与抗氧化和ACE抑制的正相关性较F-SH更强。表面疏水性与多种活性负相关，可能因为低分子量肽极性增强掩盖了疏水残基的贡献。相比之下，DPP-IV抑制活性与这些整体水解参数相关性较弱，提示其更多依赖于特定肽序列基序，而非全局结构特性。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，酶解引起的结构展开提高了酶可及性，促进了低分子量肽的释放，从而增强抗氧化和ACE抑制活性；而DPP-IV抑制活性由特定氨基酸序列和肽基序的丰度决定。该研究构建了时间分辨框架，揭示了不同水解窗口定向富集特定功能肽的可能性。结论可概括为：Alcalase水解时间显著影响CPHs的水解特性、肽谱、结构特征及多种生物活性，其中抗氧化活性在早期最高，ACE抑制活性在后期最高，而DPP-IV抑制呈双峰模式。蛋白质从有序向柔性构象转变及低分子量肽的富集与抗氧化和ACE抑制正相关，DPP-IV抑制则与特定肽基序的时间特异性释放相关。通过活性引导的肽组学和多变量分析，分别确定了LYPL/VYGPL、SGLFDK/PAALGL、SGPRLH/FAGPS作为抗氧化、ACE抑制和DPP-IV抑制的候选肽，分子对接支持其与靶标的结合。本研究为功能性食品和营养保健品中利用昆虫蛋白开发多功能肽提供了理论和实验依据，未来需进一步验证候选肽的体内活性和食品基质中的稳定性。
