利用核磁共振波谱法鉴定椴树蜜中新型糖苷Lindoside的结构与特征

《Food Chemistry: X》：Lindoside, newly identified glycoside in linden honey using NMR spectroscopy

　　

核磁共振波谱（NMR）技术因其高重现性和同时检测多种化合物的能力，正越来越多地被用于蜂蜜分析。本研究旨在阐明斯洛文尼亚椴树蜜中一种先前未被鉴定的糖苷的结构。研究人员采用固相萃取（SPE）作为唯一的分离步骤，结合先进的NMR技术，包括二维（2D）相关实验、选择性激发一维（1D）实验和扩散排序谱（DOSY），并以液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS/MS）作为独立验证手段。DOSY结果表明，该新分子的分子尺寸与已知的椴树蜜化学标记物——椴树苷（tiliaside）相当。通过异核多键相关谱（HMBC）确定了其苷元为4-(2-羟基异丙基)苯甲酸。选择性全相关谱（TOCSY）实验证实了第一个糖单元为β-葡萄糖。由于信号重叠，研究人员采用选择性TOCSY-核欧弗豪森增强谱（NOESY）实验来确认第二个糖单元的存在，并通过进一步的选择性TOCSY实验将其鉴定为β-葡萄糖。这些糖单元通过β(1→6)-糖苷键连接形成龙胆二糖（gentiobiose）。因此，该化合物的完整结构被确定为β-D-龙胆二糖-1-基 4-(2-羟基异丙-2-基)苯甲酸酯，并被命名为lindoside。对81个斯洛文尼亚蜂蜜样品的NMR图谱分析显示，lindoside在椴树蜜中的相对含量显著高于其他花种蜂蜜。这一发现表明，lindoside可作为鉴别椴树蜜真伪的新型潜在化学标记物，有助于更深入地了解椴树蜜复杂的化学成分及其潜在的生物活性。

论文解读文章

1. 研究背景与科学问题

蜂蜜是一种成分复杂的天然产物，其化学成分受植物源、地理区域、气候等多种因素影响。单花蜜因其独特的感官特性和健康益处而备受消费者青睐，因此对其真实性进行验证至关重要。传统的分析方法往往主观性强且能力有限。核磁共振波谱（NMR）技术作为一种稳健的替代方案，具有高重现性、快速以及可同时检测多种化合物的优点，尤其擅长解析未知物质的结构。在蜂蜜研究中，寻找特定于某种蜂蜜类型的化学标记物对于基于NMR的蜂蜜分类至关重要。

尽管已有研究报道了椴树蜜的一些化学标记物，如香芹酚（carvacrol）、α-松油烯（α-terpinene）以及椴树苷（tiliaside），但仍有未表征的糖苷类化合物存在。特别是，在椴树蜜的NMR图谱中，除了已知的tiliaside信号外，还存在一些低强度的、尚未归属的信号。糖苷类化合物，尤其是芳香族糖苷，被认为是潜在的生物活性物质，其结构解析对于理解蜂蜜的特性至关重要。然而，由于糖苷键易发生酸水解以及分析技术的局限性，在复杂基质中对其进行完整的结构解析极具挑战性。因此，本研究旨在利用先进的NMR技术，在不进行繁琐分离的情况下，鉴定并表征存在于椴树蜜中的一种新型糖苷。

2. 主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

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  固相萃取（SPE）：使用C18柱对斯洛文尼亚椴树蜜样品进行前处理，以去除大量糖分，富集目标糖苷组分。
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  核磁共振波谱（NMR）：运用多种NMR技术进行结构解析，包括一维（1D）¹H NMR、二维（2D）¹H-¹³C HMBC、HSQC-TOCSY、选择性1D TOCSY、选择性1D TOCSY-NOESY以及伪二维扩散排序谱（DOSY）。
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  液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS/MS）：在负离子电喷雾电离模式下获取精确质量数和碎片信息，为NMR解析出的结构提供独立的分子量和元素组成验证。

3. 研究结果与结论

3.1. ¹H NMR鉴定出带有芳香族苷元的糖苷

通过对斯洛文尼亚椴树蜜提取物的¹H NMR谱图进行分析，研究人员观察到两个芳香质子信号（δ_H 8.034 和 7.581 ppm）、一个端基双峰（δ_H 5.767 ppm）和一个脂肪族单峰（δ_H 1.515 ppm），这些信号指向一个与糖相连的苯基结构，提示存在一种新的糖苷，并将其命名为lindoside。

3.2. DOSY数据支持由苷元和两个糖单元组成的分子体系

DOSY实验结果显示，lindoside的扩散系数约为2.4 × 10^-10 m²/s，与已知的tiliaside相同。通过内部校准法（以α-葡萄糖和松二糖为标准品），估算出其分子量约为523 g/mol，与包含一个苷元和两个糖单元的预期结构（504.2 g/mol）相符，从而初步判断其由三个结构单元组成。

3.3. 通过2D HMBC谱确定苷元结构

¹H-¹³C HMBC实验揭示了关键的长程相关信号。甲基质子（H9/H10）与C4碳的相关性证明2-羟基异丙基连接在苯环的4位。同时，芳香质子（H2/H6）与羧基碳（C7）的相关性，以及该羧基碳与端基质子（H1′）的相关性，共同确定了酯键将糖环B与苷元连接起来。

3.4. 通过选择性TOCSY和HSQC-TOCSY鉴定第一个糖单元

利用对端基H1′质子的选择性激发，通过不同混合时间的1D选择性TOCSY实验，研究人员成功解析出糖单元B的所有质子信号及其耦合常数，证实其为β-葡萄糖构型。HSQC-TOCSY实验则用于归属相应的碳化学位移。

3.5. 第二个糖单元的归属

由于糖苷氧原子阻断了通过共价键的磁化转移，研究人员采用选择性TOCSY-NOESY实验。首先选择性激发H1′，再通过空间距离（NOE）选择性激发H6b′，最终检测到来自第二个糖单元端基H1″质子的NOE增强信号，证实了第二个糖单元的存在，其耦合常数（8.0 Hz）表明也为β-构型，从而确认了β(1→6)-糖苷键。随后对H1″进行选择性TOCSY实验，结果显示其自旋系统与tiliaside的第二个糖单元完全重叠，表明两者均为相同的β-葡萄糖单元，即整个糖部分为龙胆二糖（gentiobiose）。

3.6. 定量表征

通过对81个斯洛文尼亚蜂蜜样品（涵盖7种花种）进行NMR图谱分析，主成分分析（PCA）显示lindoside中2-羟基异丙基基团的信号（δ 1.58 ppm）所在的积分区域能够有效区分椴树蜜与其他花种蜂蜜。箱线图统计结果也证实，该信号在椴树蜜中的相对积分值显著高于非椴树蜜样品（p < 0.001），表明其可作为区分椴树蜜的潜在特征。

3.7. Lindoside结构表征对椴树蜜真伪鉴别及特定特性的意义

该研究证实，lindoside是存在于椴树蜜特异性NMR图谱区域的一种新型化合物，有望成为椴树蜜的化学标记物。其结构与已知的tiliaside高度相似，均含有相同的苷元和龙胆二糖单元。由于糖基部分能增加难溶苷元的溶解度和稳定性，糖苷类化合物通常是潜在的生物活性候选物。鉴于tiliaside已被证明具有抗寄生虫活性，结构相似的lindoside也可能具备类似的生物活性，这有待进一步研究。此外，本研究展示了一套高效的NMR工作流程，能够在无需质谱辅助的情况下，从复杂混合物中鉴定完整的糖苷结构。

4. 讨论与结论总结

讨论部分指出，虽然lindoside在HMBC谱中显示出与tiliaside相似的异构体簇现象，但并未影响其主要结构的确定。研究证实，所应用的NMR工作流程是分析蜂蜜中特定组分的强大工具，为探索lindoside的生物功能、规划活性测定实验以及确定其在椴树蜜特性中的作用奠定了基础。

研究结论：通过综合运用包括二维和选择性激发技术在内的NMR波谱学，研究人员成功阐明了斯洛文尼亚椴树蜜中lindoside的结构。扩散排序谱（DOSY）表明lindoside的分子大小与已知的tiliaside相当。其苷元被鉴定为2-羟基异丙基取代的苯基部分，并通过长程2D HMBC NMR谱检测到其与第一个糖单元端基质子之间的酯键连接。由于糖区信号重叠，研究人员利用对端基质子的选择性激发来确定分子糖部分的细节结构。选择性TOCSY确认第一个糖单元为β-葡萄糖。第二个糖单元的存在通过选择性TOCSY-NOESY谱检测其端基信号得到证实，并得到了DOSY结果的进一步支持。为了充分表征第二个糖单元C的自旋系统，研究人员记录了一个额外的选择性TOCSY实验，在该实验中，lindoside和tiliaside的H1″质子因信号完全重叠而被同时激发。基于选择性TOCSY谱中观察到的信号，lindoside的糖单元C是一个β-葡萄糖基团。谱图中没有任何其他信号表明，lindoside糖单元C的所有质子信号与tiliaside糖单元C的信号完全重叠，这是由于该单元结构相同所致。这一步仍然是归属的主要局限。

Lindoside的结构解析具有重要意义。首先，它在椴树蜜中的浓度高于其他花种蜂蜜，代表了一种新的、可用于验证蜂蜜植物源和品质的化学标记物。其次，lindoside的鉴定有助于更好地理解椴树蜜复杂的化学成分。第三，由于糖苷常表现出生物活性，这个新发现的分子是未来研究阐明椴树蜜特定特性（包括其生物活性）的候选对象。最后，该研究证实，所应用的NMR工作流程是分析蜂蜜中特定成分的有力工具。