黄酮类成分通过体外酶抑制与体内转录调控双重机制介导乌桕蜂蜜低淀粉酶活性

《Food Chemistry: X》：Flavonoid constituents contribute to the low diastase activity of Triadica cochinchinensis honey through in vitro enzyme inhibition and in vivo transcriptional regulation

　　

淀粉酶（diastase）是蜂蜜中的淀粉消化酶，主要由α-淀粉酶（α-amylase）组成，同时伴有β-淀粉酶（β-amylase）。α-淀粉酶在随机位点水解淀粉链，产生多种糊精，而β-淀粉酶从淀粉或糊精链的非还原端产生麦芽糖。蜂蜜中80%以上的淀粉酶来源于工蜂的咽下腺（hypopharyngeal glands），少量可能来源于植物。淀粉酶活性被广泛用作蜂蜜的关键质量参数，直接指示蜂蜜的新鲜度和加工适宜性。根据国际标准，蜂蜜淀粉酶活性必须大于8方可进行贸易和出口。然而，某些特殊蜂蜜天然呈现低淀粉酶活性，这对该指标的普遍适用性提出了挑战。乌桕蜂蜜（Triadica cochinchinensis honey, TCH）是一种代表性的天然低淀粉酶活性蜂蜜。黄酮类化合物（flavonoids）作为蜂蜜中常见且天然存在的次生代谢产物，已被报道能有效抑制α-淀粉酶活性，但鲜有研究探讨TCH来源的黄酮类化合物与其低淀粉酶活性之间的关系。本研究系统探究了TCH低淀粉酶活性的现象及其机制。研究首先比较了TCH与其他11种蜂蜜的淀粉酶活性，并进一步追踪了TCH成熟过程中的活性变化。随后，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定TCH中的特征性黄酮类化合物。本研究检验了两个假说：第一，TCH中存在的特征性黄酮类化合物直接抑制α-淀粉酶活性；第二，工蜂摄取这些黄酮类化合物会抑制其咽下腺中α-淀粉酶的分泌。这些假说通过体外酶学实验和蜜蜂（Apis mellifera）喂养实验进行了验证。最后，利用网络药理学（network pharmacology）进一步探究了黄酮类化合物、潜在靶点与α-淀粉酶相关通路之间的关系。

**论文解读**

**一、研究背景与问题提出**

淀粉酶（diastase）是蜂蜜中负责淀粉消化的关键酶类，主要由α-淀粉酶（α-amylase）和少量的β-淀粉酶（β-amylase）组成。其中，α-淀粉酶在淀粉链的随机位点进行水解，生成多种糊精，而β-淀粉酶则从淀粉链的非还原端切割产生麦芽糖。这些水解过程提高了碳水化合物利用效率，为蜜蜂提供能量。蜂蜜中80%以上的淀粉酶来源于工蜂的咽下腺（hypopharyngeal glands），仅有少量可能来自植物源。在花蜜转化为蜂蜜的过程中，工蜂分泌包括淀粉酶和蔗糖酶在内的多种酶类，将花蜜中的淀粉或二糖分解为单糖。

淀粉酶活性在国际上被广泛用作蜂蜜质量评价的核心参数，直接反映蜂蜜的新鲜度和加工适宜性。依据国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission）和欧盟蜂蜜指令2001/110/EC的规定，用于贸易和出口的蜂蜜淀粉酶活性必须大于8（以Schade单位或淀粉酶值表示）。加拿大、沙特阿拉伯以及中国（NY/T 4644-2025）的国家标准也纳入了相同要求。然而，某些特色蜂蜜天然呈现低淀粉酶活性，其中乌桕蜂蜜（Triadica cochinchinensis honey, TCH）即为典型代表。乌桕（T. cochinchinensis）是一种广泛分布于东亚至东南亚的落叶乔木或灌木，是亚热带夏季（6月至7月）主要的单花蜜源植物。TCH因其独特的风味特征和药用价值日益受到关注，但其淀粉酶活性天然低于常见商品蜂蜜品种，且这种差异不能归因于加热、加工或储存条件。

黄酮类化合物（flavonoids）是蜂蜜中普遍存在的次生代谢产物，已有研究表明其对α-淀粉酶具有显著抑制活性。例如，花青素及其苷元、具有5,6-二羟基黄酮结构的黄酮类化合物均被证实可抑制α-淀粉酶。TCH富含黄酮类成分（包括柚皮素、芦丁、槲皮素等），然而目前鲜有研究探讨TCH来源的黄酮类化合物与其低淀粉酶活性之间的关系。因此，系统阐明TCH低淀粉酶活性的现象及其机制，对于评估现行质量标准的适用性具有重要科学意义。

**二、研究内容与重要意义**

为揭示TCH天然低淀粉酶活性的内在机制，研究人员开展了系统的体内外研究。首先，研究人员比较了TCH与其他11种常见商品蜂蜜的淀粉酶活性差异，并追踪了TCH在成熟过程中的活性动态变化。在此基础上，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）全面分析了TCH、乌桕花蜜及其他蜂蜜中的黄酮类化合物组成与含量，鉴定出TCH的特征性黄酮类成分。随后，研究人员围绕两个核心假说展开验证：其一，TCH中的特征性黄酮类化合物直接抑制α-淀粉酶活性；其二，工蜂摄取这些黄酮类化合物后会抑制其咽下腺中α-淀粉酶的分泌。体外酶学实验和蜜蜂喂养实验分别用于检验上述假说，最后通过网络药理学（network pharmacology）分析进一步探究黄酮类化合物、潜在靶点与α-淀粉酶相关通路之间的关系。

该研究的重要意义在于：首次从体外酶抑制和体内转录调控两个层面揭示了TCH低淀粉酶活性的双重机制，为TCH特异性质量评价标准的建立提供了科学依据，同时提示现行以淀粉酶活性作为蜂蜜通用质量指标的做法可能不适用于TCH等特色蜂蜜。

**三、关键技术方法**

本研究涉及多层面的技术方法。样品方面，TCH和油菜蜂蜜（Brassica campestris honey, BCH）采集自江西省永修县（29°01'N, 115°29'E）的意大利蜜蜂（Apis mellifera）蜂场，其他9种单花蜂蜜和1种多花蜂蜜分别采集自中国不同地区的本地意蜂蜂场；新鲜沉积花蜜及乌桕花蜜也在相应花期采集。采用显微镜蜂蜜孢粉学分析鉴定单花蜂蜜的植物来源。淀粉酶活性依据中国国家标准（GB/T18932.16-2003）进行测定。黄酮类成分的定性与定量分析采用超高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台。α-淀粉酶抑制活性测定基于DNS法，抑制动力学通过Lineweaver-Burk双倒数作图法分析。荧光淬灭分析用于表征抑制剂与α-淀粉酶的结合特性，分子对接采用AutoDock Vina程序模拟结合模式。蜜蜂喂养实验以12日龄和22日龄工蜂为对象，设置不同饮食处理组，采用定量实时PCR（qRT-PCR）检测咽下腺中α-淀粉酶基因的相对表达水平。网络药理学整合SwissTargetPrediction和Genecards等数据库进行靶点预测和KEGG通路富集分析。

**四、主要研究结果**

**4.1 不同种类蜂蜜的淀粉酶活性分析**

研究比较了TCH与其他11种常见商品蜂蜜的淀粉酶活性。结果显示，除TCH外，其他11种蜂蜜的淀粉酶活性介于9.96至23.06之间，均满足国际标准（>8）的要求；而TCH的淀粉酶活性仅为3.45，显著低于其他蜂蜜。为追溯TCH低淀粉酶活性的来源，研究人员进一步比较了TCH和BCH在蜜蜂酿造前后的淀粉酶活性变化。结果表明，乌桕新鲜沉积花蜜的淀粉酶活性（7.81）显著高于TCH（3.45），说明TCH的低淀粉酶活性并非源于花蜜本身，而主要发生在成熟过程中。与之形成对照的是，BCH在工蜂酿造超过15天后，其淀粉酶活性显著高于油菜新鲜沉积花蜜，符合蜂蜜成熟过程中淀粉酶活性升高的普遍规律。TCH的这一反常趋势提示，在其成熟过程中可能存在某些内源性化合物抑制了淀粉酶活性。

**4.2 蜂蜜代谢组学分析**

研究人员利用LC-MS/MS对TCH、乌桕花蜜及其他11种蜂蜜的黄酮类组成和含量进行了全面分析。在TCH中共鉴定出35种黄酮类化合物，其中18种来源于花蜜植物。定量结果表明，柚皮素查尔酮（naringenin chalcone, NGC）是TCH中含量最高的黄酮类化合物，含量达872.23 ± 31.18 ng/g，其次为松属素（pinocembrin）和Baimaside。热图分析显示，NGC在TCH中的含量显著高于其他11种蜂蜜，是区分TCH与其他蜂蜜的特征性高含量黄酮类化合物。同时，(?)-没食子儿茶素没食子酸酯（(?)-gallocatechin gallate, GCG）是TCH独有的黄酮类标志物，在其他11种蜂蜜中均未检出。基于NGC在TCH中的高含量特征和GCG的独特性，两者被确定为可能贡献于TCH低淀粉酶活性的关键特征性黄酮类化合物。

**4.3 GCG和NGC对α-淀粉酶的抑制活性与动力学**

体外酶学实验表明，GCG和NGC均对α-淀粉酶水解活性表现出显著的浓度依赖性抑制效应。根据剂量-抑制活性关系曲线，GCG和NGC在反应体系中的半数抑制浓度（IC₅₀）分别约为1.25 mg/mL和0.75 mg/mL，阳性对照阿卡波糖（acarbose）的IC₅₀约为5 μg/mL。抑制动力学分析采用经典Lineweaver-Burk双倒数作图法，结果显示GCG和NGC的双倒数曲线分别相交于第三象限和第二象限，表明两者均为α-淀粉酶的可逆混合型抑制剂（mixed-type inhibitor），即GCG和NGC既能与游离酶结合，也能与酶-底物复合物结合，从而降低反应速率。

**4.4 GCG和NGC与α-淀粉酶的结合表征**

荧光淬灭分析表明，随着GCG和NGC浓度的增加，α-淀粉酶的内源荧光逐渐淬灭，且最大荧光发射波长发生轻微红移，表明抑制剂与酶蛋白的结合改变了α-淀粉酶中氨基酸残基的疏水微环境，使酶的空间结构变得更加灵活。计算得到的GCG和NGC的荧光淬灭速率常数（K_q）分别为7.65×10¹⁰ L/(mol·s)和6.40×10¹⁰ L/(mol·s)，均大于静态淬灭的阈值（2.0×10¹⁰ L/(mol·s)），表明两者与α-淀粉酶之间为静态淬灭过程，即抑制剂与荧光团形成了基态复合物。结合常数（K_a）和结合位点数（n）的计算结果显示，GCG和NGC的n值分别为0.78和0.71，均接近1，表明两者与α-淀粉酶的理论结合位点数约为1，结合作用主要发生在酶的催化活性位点。

分子对接模拟进一步揭示了GCG和NGC与α-淀粉酶的结合模式。GCG在α-淀粉酶活性中心附近的A区与Gln63、Glu233、Asp300和Gly306形成氢键，并与Trp59、Val163、Asp197和Tyr62形成π-π堆积及疏水相互作用，最小结合自由能为?8.546 kcal/mol。其中Asp197、Glu233和Asp300是α-淀粉酶的三个关键催化氨基酸残基，GCG与之形成的氢键削弱了酶与底物的亲和力。NGC与α-淀粉酶形成的次级键较少，包括与Asp197的一个氢键以及与Trp59、Ala198和Val163的疏水相互作用，结合自由能为?8.222 kcal/mol，亲和力略低于GCG，这可能归因于NGC缺乏没食子酰基且羟基数量较少。分子模拟结果与混合型抑制动力学和静态淬灭行为一致。

**4.5 TCH、GCG和NGC对工蜂咽下腺α-淀粉酶基因表达的影响**

体内喂养实验在15日龄酿蜜工蜂和25日龄采集蜂两个年龄段中均观察到一致规律。与饲喂BCH的工蜂相比，饲喂TCH的15日龄和25日龄工蜂咽下腺中α-淀粉酶基因相对表达量分别显著降低了41.10%和74.79%。鉴于BCH仅含微量NGC（22.08 ng/g）而不含GCG，TCH中GCG和NGC的存在很可能是导致α-淀粉酶基因表达降低的原因。进一步验证实验表明，与饲喂蔗糖溶液的对照组相比，补充GCG和NGC分别使15日龄工蜂的α-淀粉酶基因表达显著降低了78.92%和67.71%，25日龄工蜂则分别降低了91.14%和56.48%。在典型蜂群中，15日龄工蜂主要负责酿蜜和泌蜡，25日龄工蜂主要承担采蜜任务，两个年龄段均深度参与花蜜采集或加工过程。因此，两个年龄段工蜂α-淀粉酶表达的降低均会减少蜜蜂来源淀粉酶在花蜜采集和成熟过程中的贡献，这在一定程度上导致了TCH的低淀粉酶活性。此外，蔗糖对照组工蜂的α-淀粉酶基因表达显著高于TCH组和BCH组，这可能是因为对照日粮中50%的高蔗糖水平刺激了咽下腺中α-淀粉酶基因的表达。

**4.6 网络药理学分析**

网络药理学分析共鉴定出GCG和NGC的131个潜在靶点以及87个α-淀粉酶抑制相关基因。Venn分析揭示出四个核心潜在靶点：AMY1A、VEGFA、BCL2和PTPN1。其中AMY1A是人类基因组中α-淀粉酶基因簇的成员，与唾液α-淀粉酶表达呈正相关，且与蜜蜂α-淀粉酶基因高度保守、具有同源性。进一步KEGG富集分析显示，四个靶点显著富集于四条与α-淀粉酶相关的通路：唾液分泌通路、胰腺分泌通路、碳水化合物消化与吸收通路以及淀粉与蔗糖代谢通路。该结果表明，NGC和GCG可能通过靶向工蜂中与AMY1A、VEGFA、BCL2和PTPN1同源的基因，干扰上述四条α-淀粉酶相关通路，从而降低工蜂α-淀粉酶基因的表达。

**五、总结与结论**

综合以上结果，本研究揭示了TCH天然低淀粉酶活性的双重机制。一方面，TCH中独特的GCG和高含量的NGC通过混合型抑制直接抑制α-淀粉酶活性，两者与酶催化活性中心的关键氨基酸残基结合，改变酶的空间构象，降低其催化效率。另一方面，工蜂摄食含GCG和NGC的TCH后，其咽下腺中α-淀粉酶基因表达受到显著下调，这种转录水平的调控可能通过靶向AMY1A等关键基因并干扰α-淀粉酶相关的分泌与代谢通路实现。体外酶抑制与体内转录调控的协同作用共同导致了TCH成熟过程中淀粉酶活性的反常下降。

研究结论明确指出：TCH中天然存在的黄酮类成分——GCG（独有）和NGC（含量最高）——是导致其低淀粉酶活性的关键因素。这些黄酮类化合物发挥了双重抑制效应：其一，GCG和NGC通过混合型抑制直接抑制α-淀粉酶活性；其二，GCG和NGC的膳食补充下调了工蜂咽下腺中α-淀粉酶基因的表达，该效应可能与四条α-淀粉酶相关通路有关。这些发现为TCH天然低淀粉酶活性提供了科学解释，并对建立TCH专用质量评价标准具有重要参考价值，同时提示当前以淀粉酶活性作为蜂蜜通用质量指标的做法可能不适用于TCH等特色蜂蜜。