R1-32类公共抗体通过体细胞超突变获得对SARS-CoV-2抗原漂移的耐受及AI指导的超强效广谱中和抗体发现

《PLOS Biology》：R1-32-like public antibodies acquire tolerance to SARS-CoV-2 antigenic drift through somatic hypermutation

　　

R1-32类公共抗体（R1-32-like public antibodies）以共用IGHV1-69/IGLV1-40基因使用为特征，在超过50%的COVID-19个体中被诱导产生，并被认为在其识别的SARS-CoV-2刺突蛋白（spike protein）受体结合域（receptor-binding domain, RBD）的收敛表位（convergent epitope）内驱动了L452^SARS2和F490^SARS2的反复突变。这些突变可有效介导对具有类生殖细胞系（germline-like）序列的未亲和力成熟的R1-32类抗体的逃逸。本研究中，研究人员表征了四种亲和力成熟的人源R1-32类抗体——C092、C807、BD56-104和BD56-597——它们能耐受L452^SARS2和F490^SARS2突变。研究人员证明，这种耐受性源于体细胞超突变（somatic hypermutation, SHM）在多个CDR环（CDR loops）及周边区域中呈收敛模式引入的残基，这些残基形成额外的接触从而增强了表位结合。在BA.2.86中出现并在其子代病毒中固定下来的一个异常的N354^SARS2糖基化位点（glycosylation site），与亲和力成熟的R1-32类抗体的逃逸相关，提示该公共抗体类别正在持续施加选择压力。利用在广泛中和数据上训练的人工智能（artificial intelligence, AI）模型，研究人员进一步鉴定出ZL525——一种超强效的人源R1-32类抗体，其对包括携带N354^SARS2糖基化的高度逃逸性KP.3变异株在内的SARS-CoV-2变异株具有泛变异株活性，并且对SARS-CoV-1等具有广泛的沙贝冠状病毒（sarbecovirus）交叉反应性。综上，这些发现展示了亲和力成熟如何使公共抗体能够适应病毒的抗原漂移，揭示了它们在塑造SARS-CoV-2抗原进化中的作用，并证明了AI赋能策略在发现广谱中和抗体（broadly neutralizing antibodies）方面的潜力。

**论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

SARS-CoV-2持续进化，感染和疫苗接种所建立的免疫压力驱动刺突蛋白（spike protein）——病毒主要的表面糖蛋白和中和抗体的主要靶标——积累了大量的氨基酸替换。受体结合域（receptor-binding domain, RBD）上的若干关键残基，如K417^SARS2、L452^SARS2、E484^SARS2、F490^SARS2和N501^SARS2，已成为跨变异株反复出现的突变热点，增强了病毒的免疫逃逸能力和适应性。根据表位位置（是否与ACE2竞争结合或是否要求RBD采取“up”构象），靶向RBD的抗体被大致分为四个表位类别（epitope classes）。此外，大流行早期分离的许多RBD靶向抗体表现出低水平体细胞超突变（somatic hypermutation, SHM）的类生殖细胞系（germline-like）序列特征；其中一些抗体可按收敛的表位识别模式和共有的遗传起源归入不同的公共（群体）抗体类别（public antibody classes），这类群体水平的应答被认为对病毒施加了强大的选择压力，并为理解SARS-CoV-2抗原漂移（antigenic drift）提供了重要线索。

研究人员此前鉴定了一类R1-32类公共抗体，在大流行早期超过50%的COVID-19恢复期个体中被诱导产生。该类抗体以共用IGHV1-69/IGLV1-40基因配对为特征，依赖IGHV1-69生殖细胞系编码的疏水性HCDR2残基与RBD疏水残基L452^SARS2和F490^SARS2结合，这一特异性相互作用使它们易受L452和F490位点突变的攻击。随后，L452^SARS2和F490^SARS2确实成为病毒逃逸的突变热点：Delta变异株携带L452R^SARS2，后续Omicron亚谱系（如BA.4/5、BF.7、BQ.1.1、XBB、EG.5）则获得了L452R/Q/M^SARS2或F490S^SARS2突变，反映了这些位点持续承受免疫压力。然而，研究人员发现R1-32类公共抗体中的若干成员——包括C092、C807、BD56-104和BD56-597——仍能稳健结合携带452^SARS2和490^SARS2位点突变的变异株S蛋白，但其维持交叉变异株反应性的机制此前尚不清楚。本研究旨在阐明这些抗体突变耐受性的结构与生化基础，并进一步探索R1-32类公共抗体在病毒持续抗原漂移下的适应潜力。

**二、研究内容与重要意义**

研究人员对四种亲和力成熟的人源R1-32类抗体（C092、C807、BD56-104和BD56-597）进行了系统表征，证明它们能够耐受L452^SARS2和F490^SARS2突变，维持对携带这些逃逸突变的SARS-CoV-2变异株的高亲和力结合和强效中和活性。通过冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）结构解析和生化实验，研究人员揭示了SHM引入残基以收敛模式在多个CDR环及周边区域形成额外接触，从而增强表位结合并赋予突变耐受性的分子机制。研究发现，BA.2.86中出现并固定于其子代变异株的N354^SARS2糖基化位点介导了对这些亲和力成熟抗体的逃逸，提示该公共抗体类别对病毒施加了持续的免疫选择压力，推动了病毒进一步的抗原演化。利用在广泛中和数据上训练的AI模型，研究人员进一步发现了一种超强效R1-32类抗体ZL525，其具有泛SARS-CoV-2变异株中和活性（包括对携带N354^SARS2糖基化的高度逃逸性KP.3变异株）以及延伸至SARS-CoV-1的广谱沙贝冠状病毒交叉反应性。

该研究的科学意义在于：（1）阐明了亲和力成熟如何使公共抗体获得对病毒抗原漂移的适应能力，揭示了SHM在提高病毒逃逸的遗传屏障中的作用；（2）证明了亲和力成熟不仅增强对SARS-CoV-2表位突变的耐受，还将抗体反应性拓展至抗原性差异较大的沙贝冠状病毒，为设计不依赖高度保守表位的广谱中和抗体策略提供了新概念框架；（3）展示了AI驱动方法在加速发现针对快速进化病原体的广谱中和抗体方面的变革性潜力。

**三、主要关键技术方法**

本研究综合运用了多种关键技术方法。在抗体与抗原表达纯化方面，利用Expi293F细胞表达重组单克隆抗体（IgG和Fab片段）以及SARS-CoV-2多种变异株的S-trimer和RBD蛋白。在结合与中和活性评价方面，采用生物层干涉术（biolayer interferometry, BLI）测定抗体与抗原的结合动力学与亲和力（K_D），利用基于VSV的假病毒中和试验和基于Vero E6细胞及临床分离株的 authentic 病毒中和试验评估抗体的中和效价（IC₅₀和FRNT₅₀）。在结构解析方面，通过冷冻电镜（cryo-EM）在200 keV Talos Arctica和300 keV Titan Krios电镜上收集数据，使用cryoSPARC进行数据处理与三维重构，解析了多种Fab:ACE2:S-trimer及Fab:S1复合物的高分辨率结构（2.58–3.84 ?）。在机制验证方面，运用配体诱导的构象变化实验（proteinase K消化结合Western blot）评估抗体对S-trimer融合前构象转变的抑制能力，通过将SHM残基回复为生殖细胞系序列并进行抗原结合比较来验证关键残基的功能。在AI抗体发现方面，利用预训练的ESM2模型和抗体特异性语言模型提取序列嵌入（embeddings），通过卷积神经网络（CNN）预测抗体-抗原结合亲和力，并在752条实验确定的中和活性数据上进行微调，随后对190种R1-32类抗体进行虚拟筛选。样本队列方面，抗体分离自68名在2022年12月至2023年12月期间经历BA.5和XBB亚谱系序贯突破性感染的个体（伦理批准号：ES-2020-65）。

**四、主要研究结果**

**（1）鉴定耐受刺突蛋白突变的R1-32类公共抗体**

研究人员通过分析已发表的序列和中和数据，确认C092、C807、BD56-104和BD56-597为耐突变的R1-32类公共抗体。与仅携带极少量SHM的R1-32不同，这四种抗体的重链携带6–15个SHM，轻链携带3–4个SHM，表明经历了显著的亲和力成熟。BLI结合实验显示，四种抗体对携带L452^SARS2和F490^SARS2单突变的RBD均保持高亲和力（K_D < 1.2 nM），而类生殖细胞系的R1-32对这些突变RBD的结合显著降低（K_D = 11.8–54.2 nM）。对于同时携带L452Q^SARS2和F490S^SARS2的Lambda RBD，四种抗体的K_D仍低于6.8 nM，而R1-32的K_D约为1,000 nM（下降约1,000倍）。四种抗体对K417^SARS2、E484^SARS2和T478^SARS2位点的替换不敏感，这与这些残基位于该类抗体表位的外围或之外的结论一致。

**（2）耐突变抗体对多种SARS-CoV-2变异株保持强效中和活性**

假病毒中和试验显示，C092、C807、BD56-104和BD56-597能中和所有测试变异株（WT、Delta、Lambda、BA.1、BA.2、BA.4/5、BA.2.75.2、BQ.1.1和EG.5），IC₅₀范围为0.022–7.557 μg/mL；而R1-32对Delta、Lambda、BA.4/5、BQ.1.1和EG.5失去中和活性（IC₅₀ > 10 μg/mL）。Authentic病毒中和试验进一步证实，四种抗体对Delta、BA.5、BQ.1、XBB.1和EG.5均保持强效中和，而R1-32对这些变异株无可检测的中和活性（IC₅₀ > 100 μg/mL）。然而，所有五种抗体均丧失了对最新流行变异株KP.3的中和活性。

**（3）R1-32类抗体的结合导致S-trimer解体而不阻断ACE2结合**

C092、C807、BD56-104和BD56-597 Fab与ACE2和BA.4/5 S-trimer以1:1:1摩尔比混合后的冷冻电镜结构表明，S-trimer采取2个或3个RBD“up”构象，每个RBD同时结合ACE2和Fab，证实该类抗体不干扰ACE2结合。此外，研究人员观察到部分S-trimer在抗体和ACE2同时结合后发生解体，产生了分离的S1结构域复合物。高分辨率结构（2.58–2.83 ?）揭示四种抗体的结合模式与R1-32高度相似（Fab可变区RMSD为1.5–1.8 ?），主要利用重链（埋藏面积765–937 ?2）和轻链（353–447 ?2）共同识别RBD，其中IGHV1-69特征性HCDR2的疏水残基与RBD的F490^SARS2和L492^SARS2相互作用。

**（4）R1-32类抗体抑制刺突蛋白的融合性构象变化**

配体诱导构象变化实验表明，与WT类似，BA.4/5和EG.5.1 S-trimer可被ACE2-Fc触发产生耐proteinase K的S2融合核心。预先与C092、C807、BD56-104或BD56-597孵育的S-trimer（WT、BA.4/5及EG.5.1）无法发生ACE2诱导的融合性构象转变。相比之下，R1-32虽能有效抑制WT S-trimer的构象变化，但对BA.4/5和EG.5 S-trimer仅能部分抑制。该结果与中和试验中四种抗体对L452^SARS2/F490^SARS2变异株的优越耐受性一致，证实它们保留了通过去稳定或解体S-trimer来抑制病毒膜融合的能力。

**（5）收敛的体细胞超突变赋予增强的结合能力和突变耐受性**

通过对98种R1-32类抗体的SHM模式与中和活性的关联分析，研究人员发现若干SHM在对BQ.1.1（L452R^SARS2）和XBB（F490S^SARS2）耐受的抗体中高度富集，如重链的A33P/S^H、S35T^H、N59D^H和轻链的S26N^L、G52A/V^L、S54N/T^L。结构分析显示，C092中SHM引入的HCDR1残基N31^H和H32^H分别与RBD残基T470^SARS2和E471^SARS2形成氢键和盐桥，F33^H增强了HCDR2介导的疏水相互作用；轻链N26^L、D70^L和D99^L也参与额外抗原接触。将上述残基回复为生殖细胞系序列后，抗体对突变RBD的结合显著降低（约10–100倍）。BD56-104和BD56-597中SHM引入的HFR3残基D59^H与突变的R452^SARS2形成盐桥，直接补偿了表位突变造成的结合损失。HCDR3中的Y109^H也通过形成额外氢键和疏水相互作用增强了抗原结合。为验证这些发现，研究人员将七个关键SHM残基（A33F^H、N59D^H、Q62E^H、A109Y^H、S26D^L、G70D^L、G99D^L）引入R1-32，构建了人工亲和力成熟抗体R1-32-AAM。与R1-32相比，R1-32-AAM对携带L452^SARS2和F490^SARS2突变的RBD亲和力提高了约10–100倍，并成功中和了Delta、BA.5、XBB.1和EG.5 authentic病毒，证实了这些SHM残基在赋予突变耐受性中的核心作用。

**（6）亲和力成熟将R1-32类抗体活性拓展至SARSr-CoV RBD**

四种抗体对多种沙贝冠状病毒（SARSr-CoV）RBD表现出广泛的交叉反应性，包括1型（Pangolin-GD-2019、Bat-RaTG13、Bat-RsSHC014等）、2型（BtKY72）和3型（GX2013、HeB2013、RmYN02）RBD。其中C092和C807的结合广度和亲和力优于BD56-104和BD56-597；C807和BD56-597甚至能以较低亲和力结合SARS-CoV-1 RBD。相比之下，R1-32仅能弱结合少数SARSr-CoV RBD，对多数测试RBD则丧失结合。C092 Fab与GX2013 S1的冷冻电镜结构（3.45 ?）显示，C092在GX2013 RBD上识别相同的表位区域（埋藏面积1,003 ?2），SHM引入的残基（如F33^H、N31^H、N26^L）介导了额外的抗体-抗原相互作用，从而实现了跨物种交叉反应性。

**（7）AI指导发现超强效广谱中和抗体ZL525**

研究人员开发了基于预训练语言模型（ESM2和抗体特异性语言模型）和卷积神经网络的深度学习模型，利用752条实验确定的抗体对WT SARS-CoV-2的中和数据进行微调，预测抗体-抗原结合亲和力（测试集Pearson相关系数0.6266，Spearman相关系数0.5969）。该模型对190种R1-32类抗体进行虚拟筛选，将ZL525评为最高分候选抗体。Authentic病毒中和试验证实，ZL525能有效中和所有测试的SARS-CoV-2变异株（包括Beta、Delta、BA.1、BA.5、BQ.1、XBB.1、EG.5和KP.3），IC₅₀范围为0.044–7.193 μg/mL，对KP.3的IC₅₀为0.107 μg/mL（而前述四种抗体对KP.3完全丧失中和活性）。BLI实验显示ZL525对携带L452^SARS2和F490^SARS2突变及新出现变异株（HK.3、JD.1.1、BA.2.86、JN.1、KP.2、KP.3）的RBD均保持高亲和力（K_D < 1.11 nM），并对SARS-CoV-1等所有测试沙贝冠状病毒RBD表现出增强的交叉反应性。

**（8）ZL525耐受聚糖介导的免疫逃逸的结构基础**

ZL525 Fab与ZL58 Fab及LP.8.1 S-trimer的冷冻电镜结构（2.93 ?）显示，ZL525识别与其他R1-32类抗体相同的收敛表位。其HCDR2携带两个特征性SHM引入残基A55^H和M57^H，直接接触RBD疏水区域W452^SARS2、F490^SARS2和L492^SARS2；与C092的结构叠合显示HCDR2环发生构象扰动，使其更好地接触突变的L452W^SARS2。N354^SARS2糖基化位点恰好位于该公共抗体表位内。将C092、C807、BD56-104和BD56-597针对BA.2.86、JN.1、KP.2和KP.3 RBD的N354^SARS2糖基化进行T356K^SARS2回复突变后，四种抗体均恢复了高亲和力结合，确认N354^SARS2糖基化是导致逃逸的关键因素。对ZL525 SHM残基的系统回复突变实验表明，A55^H和M57^H是ZL525结合N354^SARS2糖基化RBD的主要决定因素，重链和轻链上分布的其他SHM也共同贡献了其卓越的聚糖耐受能力。

**五、讨论与结论**

本研究通过系统的结构和生化分析，阐明了亲和力成熟的R1-32类公共抗体（C092、C807、BD56-104、BD56-597）通过SHM引入残基介导的额外相互作用来耐受收敛表位中的L452^SARS2和F490^SARS2突变的分子机制。亲和力成熟提高了病毒逃逸的遗传屏障——病毒需要获得多个协调的表位替换才能逃逸中和，因此亲和力成熟抗体可能在更长时期内维持保护性免疫。此外，该类抗体对涵盖多种SARSr-CoV（包括穿山甲、蝙蝠和SARS-CoV-1等）RBD的广泛交叉反应性表明，亲和力成熟不仅增强了对SARS-CoV-2表位突变的耐受，还将反应性拓展至抗原性差异显著的沙贝冠状病毒，暗示SARS-CoV-2大流行后人类群体中可能已存在一定程度的针对多种沙贝冠状病毒的预存免疫。这些发现为不依赖靶向高度保守表位的广谱中和抗体设计策略提供了新概念框架。

结构分析揭示的七个关键SHM位点（A33F^H、N59D^H、Q62E^H、A109Y^H、S26D^L、G70D^L、G99D^L）与在耐受BQ.1.1和XBB的R1-32类抗体中富集的SHM位点高度重合，表明存在促进抗原漂移耐受的收敛亲和力成熟模式。基于这些位点构建的人工亲和力成熟抗体R1-32-AAM成功获得了对L452^SARS2和F490^SARS2突变的增强耐受性。

BA.2.86出现后，N354^SARS2糖基化突变已在流行株中固定下来。研究人员证明该糖基化屏蔽是驱动KP.3谱系变异株免疫逃逸的关键抗原性改变，并利用AI驱动的蛋白语言建模发现了一种超强效抗体ZL525，其能耐受该聚糖介导的逃逸机制，对KP.3保持强效中和活性（IC₅₀ = 0.107 μg/mL），并将交叉反应性延伸至SARS-CoV-1。结构分析表明，ZL525 HCDR2中SHM引入的较小或更灵活的疏水残基（A55^H、M57^H）赋予其增强的构象适应性，使其能够参与由F490^SARS2、L492^SARS2和替换后的L452W^SARS2形成的疏水表面，同时抵消N354^SARS2聚糖的屏蔽效应。

**研究结论**：这些发现共同展示了群体水平抗体应答与病毒抗原进化之间的动态相互作用，并突出了将机制免疫学与AI驱动发现相结合在加速开发针对快速进化病原体的广谱中和抗体方面的巨大潜力。