《PLOS Genetics》：Outer membrane proteins mediate unconventional secretion of Pseudomonas peroxidase through crosstalk between the Sec pathway and outer membrane vesicles
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脂蛋白（Lipoprotein）和OmpW是革兰氏阴性菌外膜（Outer Membrane，OM）的两个主要组分，在多种生理过程中发挥重要作用，如蛋白质分泌、折叠和定位。它们通常协助维持客户蛋白处于折叠状态或在分泌过程中形成孔道。然而，外膜蛋白如何促进缺乏经典
脂蛋白（Lipoprotein）和OmpW是革兰氏阴性菌外膜（Outer Membrane，OM）的两个主要组分，在多种生理过程中发挥重要作用，如蛋白质分泌、折叠和定位。它们通常协助维持客户蛋白处于折叠状态或在分泌过程中形成孔道。然而，外膜蛋白如何促进缺乏经典信号肽的蛋白质分泌仍不清楚。本研究中，研究人员证明这两种外膜蛋白参与了Pseudomonas putida中非常规B型染料脱色过氧化物酶（DypB2985）的分泌。脂蛋白Lpp1528含有一个Sec信号肽，通过Sec途径转位至周质空间并锚定于外膜内叶。Lpp1528识别细胞质中DypB2985的C端疏水区域，并促进其与Sec分泌装置的偶联以实现跨内膜转位，尽管DypB2985缺乏典型的N端Sec信号肽。转位完成后，这两种蛋白在周质中发生解离。随后，另一种外膜蛋白OmpW4836识别周质中DypB2985的N端疏水区域，并介导其整合进入外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles，OMVs）以实现胞外递送。研究人员的研究揭示了Sec途径与OMVs在一种非经典过氧化物酶分泌过程中的交叉对话，其中外膜蛋白作为分子纽带介导了逐步分泌过程。该研究拓展了研究人员对非经典蛋白质分泌机制和细菌生存策略的理解。此外，所鉴定的OMV分选机制为将OMVs进一步功能化发展为多功能生物技术平台提供了可能。
**论文解读：外膜蛋白介导假单胞菌过氧化物酶非常规分泌的分子机制**
**一、研究背景与科学问题**
蛋白质分泌是细菌维持正常生理功能以及与外界环境进行物质交换和信息交流的核心过程。在经典分泌模式中，待分泌蛋白通常携带保守的信号肽或分泌基序（motif），在细胞质中以前体形式合成后，经过Sec途径（general secretion pathway）、信号识别颗粒途径（SRP pathway，signal recognition particle pathway）或双精氨酸转位途径（Tat pathway，twin arginine translocation pathway）等经典分泌通路实现跨膜运输。以Sec途径为例，分子伴侣SecB识别前体蛋白N端的Sec信号肽，维持其处于未折叠构象并将其递呈给ATPase马达蛋白SecA，SecA进而驱动前体蛋白穿越细胞质膜上的SecYEG蛋白通道。然而，越来越多的研究发现，许多不含任何经典信号肽或分泌基序的蛋白质同样能够被分泌到胞外环境，被归类为非经典分泌蛋白（non-classically secreted proteins）。由于非经典分泌蛋白末端序列在氨基酸组成和特征上相似性很低，其分泌机制被认为高度多样化且可能针对不同底物量身定制。
目前该领域存在两个核心未解问题：其一，分泌装置如何在细胞质中识别缺乏信号肽的待分泌蛋白；其二，跨膜转位过程如何实现，尤其是外膜囊泡（OMVs）作为革兰氏阴性菌重要的胞外递送载体，其选择性分选和包装特定货物蛋白的机制尚不清楚。已知的辅助蛋白（accessory proteins）数量极少，与不断增长的非经典分泌蛋白数量形成鲜明对比。该研究以Pseudomonas putida A514中一种缺乏信号肽却能在周质和胞外被检测到的B型染料脱色过氧化物酶DypB2985为研究对象，系统探究其非经典分泌途径。
**二、研究意义与主要结论**
研究人员通过免疫共沉淀偶联质谱（co-IP-MS）筛选、基因敲除与互补实验、蛋白定位与互作分析等一系列实验，鉴定了两个关键外膜蛋白——脂蛋白Lpp1528和OmpW4836，揭示了DypB2985的分步分泌模型。Lpp1528本身携带Sec信号肽，经Sec途径转位至周质后锚定于外膜内叶；同时，Lpp1528在细胞质中识别DypB2985的C端疏水区域，将其偶联至SecYEG转位通道以实现跨内膜运输。进入周质后，两种蛋白解离，随后OmpW4836识别周质中DypB2985的N端疏水区域，介导其分选整合至OMVs表面，最终随囊泡释放至胞外。该研究不仅拓展了非经典蛋白质分泌的辅助蛋白库，还阐明了OMVs货物分选的一种新机制，为工程化OMVs作为生物催化平台提供了理论基础。
**三、关键技术与方法概述**
研究人员采用的主要技术方法包括：（1）免疫共沉淀偶联质谱分析（co-IP-MS）筛选与DypB2985互作的候选蛋白；（2）基于CRISPR/Cas9n的基因组编辑技术构建lpp1528、ompW4836、dnaK4638和duf49381524等基因的敲除突变株，并进行回补实验；（3）渗透休克法提取周质蛋白，超速离心法分离纯化OMVs；（4）Western blot和ELISA定量分析DypB2985在不同细胞区室中的蛋白水平；（5）GST pull-down实验验证蛋白间体外相互作用；（6）Blue Native PAGE分析体内蛋白复合物形成；（7）蛋白酶K处理结合Western blot确定DypB2985在OMVs上的定位（表面展示）；（8）N端和C端截短实验定位DypB2985与Lpp1528和OmpW4836的互作区域。所有实验以P. putida A514及相关衍生菌株为宿主，在LB或M9葡萄糖培养基中培养。
**四、主要研究结果**
（一）Co-IP-MS揭示参与非常规DypB2985分泌的候选蛋白
Western blot分析证实DypB2985存在于周质和胞外区室（包括OMVs和培养上清）。蛋白酶K处理实验表明DypB2985定位于OMVs表面，而非被包裹在囊泡内部。信号肽预测工具（SignalP 6.0、TargetP 2.0和SecretomeP 2.0）均未在DypB2985中识别到任何经典N端或C端信号序列。通过co-IP-MS分析，共鉴定到109个在Flag-DypB2985组中显著富集的蛋白，其中8个蛋白曾被认为与分子转位相关，涵盖分子伴侣（DnaK4638、SurA4963）、脂蛋白和OMV相关蛋白（Lpp1528、OmpW4836、OprD1944、OprI0982、BamC1279）以及含未知功能结构域蛋白（DUF49381524）。研究人员从中选取丰度最高的DnaK4638、Lpp1528、OmpW4836和DUF49381524进行co-IP验证，确认Lpp1528和OmpW4836与DypB2985存在互作。基因敲除实验表明，删除lpp1528导致周质DypB2985水平降低约60%，删除ompW4836则完全消除了OMVs中的胞外DypB2985，而删除dnaK4638和duf49381524对DypB2985的胞内外水平无显著影响。
（二）DypB2985的C端残基是与Lpp1528互作所必需的
lpp1528的缺失损害了DypB2985向周质的转位，而回补lpp1528后周质DypB2985水平恢复至对照菌株的90%，周质酶活恢复至95%。为阐明Lpp1528识别DypB2985的分子机制，研究人员对DypB2985的N端和C端分别进行了6、12、18和24个氨基酸的逐步截短。结果表明，N端截短18个氨基酸对周质蛋白水平无显著影响，截短24个氨基酸使其降低42%；而C端截短仅6个氨基酸就使周质蛋白水平骤降74%，截短12–24个氨基酸进一步降低80%–84%。co-IP实验显示Lpp1528无法与DypB2985ΔC24结合，但仍能结合DypB2985ΔN24和DypB2985ΔC6。进一步定位将Lpp1528识别位点确定在DypB2985的C端疏水区域（第296–320位残基）。体外pull-down实验未检测到Lpp1528与DypB2985的直接物理互作，但使用A2985细胞裂解液时可检测到结合，提示二者结合依赖于胞内因子或特定体内条件。Lpp1528含有Sec信号肽并定位于周质空间，可与SecA4176、SecB5893及SecYEG复合物互作，支持其Sec依赖的分泌方式。SecYEG与DypB2985之间的体内互作也被检测到，且Lpp1528、SecYEG与DypB2985三者之间的互作是瞬时的，与分泌途径中货物-受体动态行为一致。
（三）OmpW4836介导DypB2985分选进入OMVs进行胞外递送
删除ompW4836导致OMVs和培养上清中胞外DypB2985水平严重下降，而OMV产量和蛋白组成未发生显著变化。回补ompW4836可恢复胞外DypB2985水平。对N端和C端截短突变体的分析显示，N端截短12–24个氨基酸使OMVs中DypB2985水平降低82%–96%，其中ΔN24几乎完全消除了OMVs中的DypB2985，并破坏了DypB2985与OmpW4836的互作；而C端截短24个氨基酸的突变体仍保留与OmpW4836的互作能力，OMVs中DypB2985水平仅降低22%。这些结果表明OmpW4836通过DypB2985的N端区域（第1–24位残基）识别该蛋白，并介导其整合进入OMVs。
（四）P. putida DypB2985的分泌模型
删除lpp1528或ompW4836均未显著影响细胞生长或细胞被膜完整性。lpp1528缺失使周质DypB2985降低60%，ompW4836缺失则显著损害胞外DypB2985水平而周质水平基本不变。DypB2985在细胞质和周质中均表现出酶活，分别为22,652 U/L和2,799 U/L，提示仅小部分DypB2985被转位跨膜。基于上述结果，研究人员提出两步转位模型：首先，SecB5893识别Lpp1528的Sec信号肽并将其递呈给SecA4176，SecA4176水解ATP后激活SecYEG转位通道，Lpp1528跨内膜转位；同时，Lpp1528作为DypB2985的适配器，识别其C端区域并将其桥联至SecYEG通道，DypB2985在胞质分子伴侣DnaK4638的保护下以未折叠状态穿越内膜。进入周质后，DypB2985与Lpp1528解离，Lpp1528经Lol依赖途径被靶向至外膜内叶。DypB2985在周质分子伴侣SurA协助下折叠，随后OmpW4836识别其N端区域并介导其分选至OMVs表面，最终随囊泡分泌释放至胞外环境。
**五、讨论与结论**
该研究在讨论部分指出，细菌蛋白质分泌是基础性生理过程，经典机制依赖保守信号肽被相应分泌组分识别，而非经典分泌蛋白因缺乏信号基序而机制多样、依赖于特定底物策略。已知的非经典分泌途径在革兰氏阳性菌中报道较多，而在拥有从T0SS到T7SS等多种复杂分泌系统的革兰氏阴性菌中报道较少。该研究揭示了Sec途径与OMV途径协同运作的新分泌路线，其中Lpp1528负责Sec依赖的跨内膜转位，OmpW4836专门负责OMV包裹的胞外递送，二者形成了功能分工。分子伴侣DnaK4638虽在co-IP-MS中富集，但主要维持DypB2985的溶解性和转位感受态，并不直接参与转位本身。Lpp1528作为脂蛋白携带保守脂盒（lipobox，序列Leu-Ala-Gly-Cys），遵循"+2"规则（第二位为丝氨酸），预示其经Lol依赖途径定位于外膜内叶。该研究将脂蛋白在蛋白质分泌中的分子纽带作用从Paenibacillus sp. W-61的LppX拓展至革兰氏阴性菌体系。值得注意的是，Lpp1528与DypB2985的互作是间接的，依赖于细胞环境或辅助因子；且lpp1528敲除并未完全消除周质DypB2985，N端24个氨基酸截短也仅降低42%的周质水平，提示DypB2985可能存在多条冗余分泌途径以确保周质定位。关于OmpW，该研究指出OmpW家族蛋白通常形成八链β-桶状结构，其狭窄疏水孔道（半径约1.3 ?）传统上被认为用于小分子（<660 Da）的跨膜运输，但AlkL蛋白可通过桶状延伸产生动态侧向出口以容纳烷烃等稍大分子。OmpW同时也是OMVs的组成成分。该研究明确了OmpW4836通过蛋白-蛋白互作选择性分选DypB2985进入OMVs，为克服OMVs货物分选机制不清的瓶颈提供了新见解。
研究结论部分指出：该研究揭示了P. putida中过氧化物酶DypB2985的一条非经典分泌途径。P. putida利用外膜蛋白协调经典Sec途径和OMVs以实现该非常规蛋白的输出。这代表了一种节约成本的生存策略，使细菌能够在动态营养环境中灵活利用现有系统。脂蛋白将DypB2985与经典Sec途径连接起来，拓展了辅助蛋白的种类。此外，研究探索了OMV蛋白分选机制，OmpW在将DypB2985分选进入OMVs中发挥关键作用，为未来工程化OMV货物组成提供了有前景的策略。
