《PLOS Genetics》：Assessing Hardy-Weinberg equilibrium in T2T-aligned 1000 genomes project
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全基因组关联研究中的标记质量控制通常包括Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验。然而，该检验通常在未按性别分层的同质人群中进行。既往研究表明，在主动招募的队列中，多个常染色体位点存在基于性别的选择。性染色体序列也可能干扰常染色体SNP。这些情况促使研究
全基因组关联研究中的标记质量控制通常包括Hardy-Weinberg平衡（HWE）检验。然而，该检验通常在未按性别分层的同质人群中进行。既往研究表明，在主动招募的队列中，多个常染色体位点存在基于性别的选择。性染色体序列也可能干扰常染色体SNP。这些情况促使研究人员在性别感知分析中重新审视HWE。研究人员利用端粒到端粒（T2Tv2）比对的来自1000 Genomes Project中2,490名个体的高深度全基因组测序数据，在五个超级人群中检查了全基因组性别特异的HWE偏离。分析仅限于在五个超级人群的两种性别中基因型非缺失且最小等位基因频率（MAF）≥5%的双等位SNP。研究人员采用基于等位基因的框架量化Hardy-Weinberg不平衡（HWD）的大小和方向，随后进行二阶合并meta分析，将各人群和性别的HWD结果合并。在全基因组显著性阈值p<5e-8下，0.9%的常染色体SNP表现出显著的HWE偏离。这些偏离大多与指示测序质量较差的基因组特征相关。将分析限制在可靠基因组区域后，信号数量大幅减少，得到255个常染色体SNP和1个非假常染色体区X染色体SNP。其中，140个常染色体SNP在人群间表现出显著异质性，但性别间无显著异质性。值得注意的是，位于染色体14q31.3上15-bp区域内的8个SNP在非洲超级人群（AFR）的两种性别中均表现出杂合子过量。最后，研究人员基于序列特征开发了HWD的多变量预测因子，为全基因组测序研究提供了一种可整合到现有质量控制流程中的实用工具。
研究背景与问题
Hardy-Weinberg平衡（HWE，群体中基因型频率仅由等位基因频率决定的状态）是群体遗传学的基本原则，也是全基因组关联研究（GWAS）标记质量控制中的常用检验。传统HWE检验通常针对未按性别分层的同质人群，忽视性别分层、性染色体序列干扰、参与偏倚等因素。已有研究（Graffelman等，2017）在GRCh37比对的1000 Genomes Project（1KGP）三期低深度数据中发现HWE偏离与测序深度有关；Pirastu等（2021）在主动招募队列中报道了常染色体上存在性别相关位点。由于性别间最小等位基因频率差异（sdMAF）以及旁系同源序列变异（PSV）导致的性染色体与常染色体交叉比对都可能造成Hardy-Weinberg不平衡（HWD），研究人员利用T2T-CHM13v2.0比对的1KGP高深度全基因组测序数据，开展了性别与超级人群分层的HWE再评估。
研究内容与主要结论
研究人员使用1KGP中2,490个无关个体（女性1,263人，男性1,227人）的T2T-CHM13v2.0高深度全基因组测序数据（v2），按五个超级人群（南亚SAS、东亚EAS、欧洲EUR、混血美洲AMR、非洲AFR）和性别分为10组。分析限定为双等位、无缺失基因型且MAF≥5%的SNP，采用基于等位基因的δ统计量量化HWD的大小和方向，并通过二阶omnibus meta分析合并10组结果，再用异质性检验比较组间差异。同时，研究人员整合T2T Consortium、Genome in a Bottle（GIAB）、Illumina等来源的序列注释定义“可靠区域”，过滤难以准确测序的区域；随后基于五种二元基因组特征构建logistic回归预测模型。此外，研究人员在ASW（美国西南部非裔）和ACB（巴巴多斯非裔加勒比）两个近期混合人群中比较了常染色体与X染色体非假常染色体区（NPR）的HWD。
研究结果
数据概况（1000 Genomes project data）：v2数据共包含约1,100万个双等位非缺失SNP，其中常染色体10,984,307个，NPR 383,435个，PAR1 16,217个，PAR2 1,006个；各超级人群和性别组合中MAF≥5%的SNP数量从EAS男性的4,987,954到AFR女性的7,918,101不等。
按性别和超级人群分层的HWD及meta分析（HWD stratified by sex and super-population and meta-analyses）：常染色体HWD模式在各组中相似，多位于端粒和着丝粒附近。在omnibus meta分析中，3,377,201个常染色体SNP中有0.9%达到全基因组显著水平（p<5e-8）；其中约一半同时表现出HWE异质性。另有7个SNP仅在异质性检验中显著，表明不同组的偏离方向可能相反。X染色体方面，男性在PAR1和PAR2的着丝粒边界附近、女性在靠近PAR1的NPR区域表现出较高HWD。
基因组特征对HWD的影响（Effect of genomic features on HWD）：困难测序区域、片段重复、着丝粒/卫星区域等负向基因组特征显著富集HWD；这三类特征合计占常染色体SNP不足10%，却解释了96%的显著HWD信号。将分析限制到可靠区域后，常染色体显著HWD SNP从30,938个降至255个，NPR显著SNP降至1个；PAR区域由于仅能过滤困难测序区域，HWD比例变化不大。
可靠区域中具omnibus HWD的SNP（SNPs with omnibus HWD in reliable regions）：255个常染色体显著SNP分布在90个100kb非重叠区间内。其中140个SNP在超级人群间表现出显著异质性，但没有任何SNP在性别间表现出显著异质性；200个SNP在所有组中δ为负，即杂合子过量。特别地，14q31.3区域15-bp范围内的8个SNP在AFR超级人群中超过90%个体为杂合子，且参考序列与替代序列互为反向互补，等位基因深度比约为5:1，提示该区域可能存在难以准确基因分型的重复变异。
PAR中的HWD（HWD in PARs）：去除困难测序区域后，PAR1和PAR2分别有44个和31个SNP在omnibus分析中显著。男性在PAR–NPR边界附近HWD更高，且这些信号主要由超级人群间异质性驱动。
性别间HWD差异（sdHWD）：共发现80个SNP存在性别间HWD差异，其中多数位于PAR；过滤至可靠区域后，无常染色体sdHWD SNP，仅1个PAR2 SNP保留。
常染色体HWD的多变量基因组特征模型：采用奇数常染色体训练、偶数常染色体测试的logistic回归模型预测SNP是否显著HWD，AUC达到99.4%，表明序列特征可高准确度识别易发生HWD的位点。
近期混合人群中常染色体与NPR的HWD比较：在ASW和ACB人群中，78个常染色体SNP偏离HWE，而NPR中没有SNP偏离；偏离HWE的常染色体SNP主要表现为杂合子过量，与理论预期并不完全一致。
讨论与结论
讨论部分指出，大部分表观HWD信号与测序和比对质量有关，而不是真实的生物学信号，因此基于序列特征过滤可大幅降低假阳性。与单纯依赖显著性检验不同，该研究提供了有方向的组特异性δ估计，能够区分各人群共享的HWD和人群/性别特异的HWD。研究还提示，在男性PAR区域使用性别特异的HWE过滤可能会无意中移除真实变异，需要谨慎解释。研究结论是：在T2T-CHM13v2.0比对的高深度1KGP数据中，经过可靠区域过滤后仍存在少量与复杂序列结构相关的HWD信号；研究人员开发的基于基因组特征的多变量预测工具可整合到现有全基因组测序质量控制流程中，有助于提高GWAS等下游分析的可靠性。
