《Cellular Signalling》：Antitumor effects of isoliquiritin on oral squamous cell carcinoma by VEGFC/FLT4-PI3K/AKT signaling axis
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摘要目的异甘草素（ISLT）是从甘草中分离得到的主要黄酮苷类化合物，在包括肺癌和肝癌在内的多种实体恶性肿瘤中表现出显著的抗肿瘤活性。本研究旨在探讨ISLT对口腔鳞状细胞癌（OSCC）的治疗作用及其机制。方法采用CCK-8、集落形成实验和Ki67检测细胞增殖情况。通过流式细胞术
摘要
目的
异甘草素（ISLT）是从甘草中分离得到的主要黄酮苷类化合物，在包括肺癌和肝癌在内的多种实体恶性肿瘤中表现出显著的抗肿瘤活性。本研究旨在探讨ISLT对口腔鳞状细胞癌（OSCC）的治疗作用及其机制。
方法
采用CCK-8、集落形成实验和Ki67检测细胞增殖情况。通过流式细胞术和活/死细胞染色检测细胞毒性效应。采用划痕实验和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。进一步通过转录组测序结合分子对接，鉴定ISLT治疗OSCC的关键分子——Fms相关受体酪氨酸激酶4（FLT4），又称血管内皮生长因子受体3（VEGFR3）。随后构建FLT4敲低细胞，通过细胞表型检测和蛋白质表达水平变化，确定FLT4对OSCC细胞的调控作用及下游分子机制。最后构建OSCC小鼠模型，在体内验证ISLT的治疗效果和生物安全性。
结果
结果表明，ISLT以剂量依赖方式抑制OSCC细胞增殖，在20 μg/mL时抑制效果显著。ISLT提高了凋亡率，对OSCC细胞具有显著的杀伤作用，同时显著抑制了具有高转移和侵袭潜力的OSCC细胞的迁移和侵袭。在基因表达水平上，ISLT处理显著上调了P53、Bax和Caspase-3的mRNA水平，同时下调了Bcl-2的表达，导致Bax/Bcl-2比值升高。ISLT的靶点FLT4通过转录组测序和分子对接筛选得到。研究发现，敲低FLT4同样可以显著抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，并可促进凋亡。在蛋白质水平上，敲低FLT4后凋亡相关蛋白表达水平的变化趋势与ISLT所致效应一致。进一步对下游分子机制的研究显示，敲低FLT4后磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（AKT）的磷酸化水平显著下调，导致磷酸化PI3K（p-PI3K）/PI3K和磷酸化AKT（p-AKT）/AKT比值降低。最后，体内研究表明ISLT可显著缩小OSCC肿瘤体积，且不引起任何器官毒性。
结论
本研究揭示了ISLT对OSCC具有抗肿瘤活性，为中医药治疗人类癌症提供了新的思路。
引言
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部最常见的侵袭性恶性肿瘤，全球年发病率超过30万例，五年生存率持续停滞在50%–60%之间[1]、[2]。其临床挑战主要来自早期症状隐匿和转移潜力高，约40%的患者在诊断时已出现区域淋巴结转移，术后复发率高达40%–50%[3]、[4]。目前的治疗策略主要涉及手术切除、放疗、化疗或上述方法的联合应用。然而，这些方法往往难以达到满意的效果，且伴随术后感染、免疫抑制和继发恶性肿瘤风险增加等并发症。尽管临床诊断和治疗技术取得了显著进步，OSCC患者的五年生存率仍未得到显著改善[5]。因此，迫切需要开发能够有效抑制OSCC进展的新型药物。
异甘草素（ISLT）是从甘草中提取的主要黄酮苷类化合物[6]、[7]，具有广泛的药理活性，包括抗血管生成、神经保护和抗肿瘤作用[8]。既往研究表明，甘草对多种肿瘤的细胞毒性作用主要来源于其各种黄酮类和三萜类化合物[9]，其中黄酮类是核心成分[10]。在所研究的10种甘草黄酮中，ISLT表现出较高的肿瘤选择性，凸显了其作为靶向抗癌化合物的潜力[11]。目前的研究结果表明，ISLT对多种肿瘤如咽鳞状细胞癌[12]、乳腺癌[13]和消化系统恶性肿瘤[10]具有显著的杀伤作用。因此，本研究认为ISLT可能对口腔鳞状细胞癌（OSCC）具有一定的抗肿瘤效果。
OSCC的迁移、侵袭和血管生成高度相关[14]，而血管和淋巴管的形成受血管内皮生长因子C（VEGFC）/Fms相关受体酪氨酸激酶4（FLT4，又称血管内皮生长因子受体3，VEGFR3）信号轴的调控[15]。研究表明，OSCC细胞可通过自分泌机制激活VEGFC/FLT4信号轴，促进增殖、迁移和淋巴结转移[11]、[16]、[17]。在肿瘤微环境中，VEGFC介导的FLT4激活触发了磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路的磷酸化级联反应，促进淋巴管形成以及肿瘤细胞的侵袭和转移[18]、[19]。此外，现有研究表明ISLT抑制肿瘤的潜在机制可能与调控或抑制肿瘤细胞凋亡基因，或抑制肿瘤血管生成有关[9]。因此，本研究旨在探讨ISLT是否可通过抑制VEGFC/FLT4-PI3K/AKT通路来发挥对口腔鳞状细胞癌细胞的杀伤作用。
章节摘要
细胞培养
人OSCC细胞系SCC9和Cal27购自ATCC。细胞分别培养于DMEM/F-12或DMEM培养基（均购自Gibco，美国纽约州大岛市）中，补充10%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素-链霉素（Gibco），在37°C、5% CO?条件下维持培养。
转染程序
将SCC9和Cal27细胞分别以每孔1 × 105和2 × 105个细胞的密度接种于六孔板中，在完全培养基中培养。转染前，细胞生长至约60%–70%
ISLT的体外抗肿瘤效果
首先，采用CCK-8实验评估ISLT对SCC9和Cal27细胞活力的影响。结果表明ISLT显著降低了两种细胞系的活力，且抑制作用呈现明显的浓度依赖性模式（图1A）。为进一步验证ISLT的增殖抑制效果，通过Ki67免疫荧光染色和集落形成实验分析细胞增殖活性（图1B、F）。与对照组相比，SCC9
讨论
OSCC是口腔中最常见的恶性肿瘤[20]，其特征为早期症状不明显、侵袭性强且淋巴结转移风险高。目前，OSCC主要通过手术进行治疗，辅以放疗、化疗、靶向治疗和细胞治疗[21]。不幸的是，传统手术治疗可能存在各种禁忌症。此外，尽管表皮生长因子受体抑制剂等靶向药物
结论
本研究凸显了异甘草素可显著抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。ISLT通过作用于FLT4受体，抑制下游PI3K/AKT信号通路的转录活性和磷酸化过程来发挥抗肿瘤作用。同时抑制GSK-3β/FOXO1的磷酸化，导致凋亡相关标志物表达增加，表明ISLT具有诱导
CRediT作者贡献声明
秦奕文：调查、数据整理、写作——初稿。吴涵：调查、写作——初稿。王银雨：资金获取、写作——初稿。庄紫乔：数据整理、写作——初稿。马凤媛：方法论、写作——初稿。刘薇薇：资金获取、写作——审阅与编辑。陈诗豪：写作——初稿。萧肇荣：写作——初稿。施鹤：写作——初稿。王东旭：写作——审阅与编辑。
伦理审批与参与同意
本研究方案经吉林大学生物医学研究伦理委员会审查并批准（决定书编号：JDKQ20250312）。
资金资助
本工作得到吉林省自然科学基金（项目编号：YDZJ202301ZYTS166）和白城医学高等专科学校甘草项目（项目编号：BCGC202410）的资助。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
刘薇薇声明获得吉林大学口腔医院提供的财务支持。王银雨声明获得白城医学高等专科学校提供的财务支持。如有其他作者，声明不存在可能影响本文工作的已知竞争性财务利益或个人关系。
致谢
感谢吉林大学动物科学实验动物中心和吉林大学口腔医院的动物中心提供的强大技术支持。
秦奕文|吴涵|王银雨|庄紫乔|马凤媛|陈诗豪|萧肇荣|施鹤|王东旭|刘薇薇
吉林大学口腔医院口腔颌面外科，中国长春130021
