通过cRGD脂质体包载PROTAC靶向降解VEGFR2逆转病理性角膜新生血管

《Biomaterials》：Targeted Degradation of VEGFR2 via PROTAC encapsulated by cRGD-Liposome Reverses Pathological Corneal Neovascularization

　　• 新型PROTAC-V2可实现VEGFR2的特异性催化降解。• cRGD-LNP系统有助于靶向递送PROTAC进入细胞内。• 局部制剂可实现角膜基质的有效渗透。• cRGD-LNP@V2在CoNV模型中展现出更优的治疗效果。## 引言角膜新生血管（CoNV）是一种威胁视力的疾病，表现为血管侵入本应无血管的角膜组织。通过慢性炎症和瘢痕形成损害角膜透明度，CoNV仍是全球范围内严重视力丧失的主要原因之一。[1] 该疾病是多种眼部损伤的最终共同通路，包括感染性角膜炎、化学烧伤、创伤以及因过度佩戴隐形眼镜引起的慢性缺氧，影响着全球数百万患者。[2] 角膜的无血管状态——被称为"血管生成特权"——由促血管生成因子与抗血管生成抑制因子之间的微妙平衡主动维持。[3] 病理性触发因素破坏这种稳态，形成促炎和缺氧的微环境，从而上调强效的血管生成介质。[4] 其中，血管内皮生长因子（VEGF）信号通路，特别是通过其受体VEGFR2，已被确定为CoNV的主要驱动因素。在机制上，角膜基质中病理性上调的VEGF与局部内皮细胞上的VEGFR2结合，诱导受体二聚化和自磷酸化。这种激活刺激下游PI3K/AKT信号级联，该通路是驱动血管内皮细胞增殖、迁移和存活以形成新毛细血管网络的主要通路。此外，这一血管生成反应与VEGFR1介导的炎症反应紧密偶联。虽然VEGFR1可作为高亲和力"诱饵"受体，但其激活也促进巨噬细胞趋化招募和向基质浸润，建立起炎症-血管生成正反馈环路，加速CoNV进展。[5] 因此，治疗策略主要集中在抑制这一轴。虽然靶向VEGFR2的受体酪氨酸激酶抑制剂（RTKIs）已显示临床效用，但其长期疗效常被重大障碍所削弱，包括眼部生物利用度差、剂量限制性脱靶毒性以及获得性耐药性的产生。[6][7][8] 这些药物的根本局限性在于其基于占据作用机制，需要持续高浓度的化学计量相互作用来瞬时阻断激酶活性。这种范式在面对靶蛋白过度表达或损害药物结合亲和力的突变时极易失效，这是常见的治疗逃逸机制。[9][10]为了规避基于占据作用抑制剂的固有局限性，诱导蛋白降解已成为一种范式转移性的治疗模态。具体而言，裂解靶向嵌合体（PROTACs）利用催化机制实现病理性蛋白的靶向消除，而非仅仅抑制其功能。[11][12] 然而，将该技术应用于膜蛋白（TMPs），如VEGFR2，存在独特的生物物理挑战。历史上，TMPs的降解受到两个主要障碍的阻碍：空间隔离，即胞质E3连接酶（如VHL、CRBN）在物理上与其细胞外结构域分离；以及结构限制，即从脂质双分子层中提取疏水性跨膜螺旋以供蛋白酶体加工在热力学上是不利的。[13][14] 然而，如果PROTAC能够结合可及的胞内结构域以跨越空间间隙，这些障碍是可以被克服的。[14]基于这一原理，我们策略性地设计了PROTAC-V2，将强效多激酶抑制剂ABT-869重新利用作为靶标结合弹头。ABT-869的选择至关重要——不同于细胞外抗体，这一小分子结合在VEGFR2激酶结构域胞内ATP结合口袋的深处，特异性地稳定受体于非活性"DFG-out"构象。[15][16][17] 这种精确的结合模式确保了受体胞质段的高亲和力识别，使偶联的VHL E3连接酶能够有效将泛素-蛋白酶体系统招募至膜表面。[18] 在结构上，PROTAC-V2采用优化的十二烷二酸连接子（n=10）来协调整合体所需的三维几何构型。该复合物触发胞质赖氨酸残基的多聚泛素化，启动受体的催化性提取和降解，从而沉默PI3K/AKT/mTOR信号轴。[19][20]尽管在分子层面高度有效，PROTAC-V2的临床转化受限于其固有的物理化学局限性。作为高分子量异双功能分子，它超出了Lipinski"五法则"范围。其结构刚性、丰富的氢键供体/受体以及显著的疏水性导致在水溶液中聚集，并导致膜通透性差。[21][22] 为了克服这些热力学和质量传输障碍，我们工程化了cRGD-LNP@V2——一种靶向纳米药物平台。从材料科学角度，我们选择脂质-聚合物杂化结构作为功能性递送载体，而非简单的被动载体。首先，特定的脂质组成（包含刚性HSPC和胆固醇）形成稳定的外层壳，而整合的聚己内酯（PCL）嵌段提供热力学上有利的疏水核心。该聚合物核心有效容纳PROTAC-V2庞大的结构构象，防止过早沉淀，相较于常规聚合物胶束实现更好的结构稳定性。[23][24] 此外，为了克服生理性眼部界面障碍——即泪液快速更新和带负电荷、高粘度的角膜黏蛋白层——纳米载体表面修饰了mPEG冠。这种PEG化策略赋予必要的隐形特性，最小化黏附作用并促进透过泪膜的渗透。同时，环状RGD（cRGD）肽的功能化将细胞进入机制从非特异性被动扩散转变为受体介导的内吞。通过结合增殖内皮细胞上调的αvβ3整合素，cRGD-LNP促进庞大PROTAC药物载体直接递送至目标胞质。[25] 这种集成材料工程策略确保PROTAC被溶解、在眼部黏膜界面受到保护，并精确递送至病理性新生血管。通过将纳米载体增强的生物利用度与cRGD介导的主动靶向相结合，这种双重策略确保PROTAC-V2能有效跨越强大的生理性眼部屏障，并在血管内皮中实现精确的局部特异性蓄积。我们的体内研究（在缝合术和碱烧伤诱导的损伤模型中进行）表明，cRGD-LNP@V2实现了对新生血管生长的深刻且持续的抑制，表现为血管密度和角膜浑浊的显著降低。值得注意的是，该纳米制剂的治疗效果显著优于非靶向PROTAC，这归因于角膜基质滞留增强和整合素靶向细胞摄取产生的协同效应。此外，本研究首次全面验证了该PROTAC分子在复杂眼部环境中的应用，填补了体外蛋白敲低与体内治疗效果之间的鸿沟。通过确认VEGFR2/AKT/mTOR信号轴的稳定沉默以及下游促血管生成效应子（如VEGFR1和CD146）的后续下调，我们确立了靶向蛋白降解（TPD）范式作为抗血管生成眼部治疗的赋能性优越策略。这些发现不仅突显了cRGD-LNP@V2的精确性，还为管理难治性新生血管眼病提供了传统基于占据作用抑制剂的强效替代方案。## 章节摘要### PROTAC-V2的表征与分子动力学模拟结构与先前报道的类似物类似，[26] 我们设计的化合物PROTAC-V2具有更长的十二烷二酸连接子（n=10），以优化E3连接酶与VEGFR2之间的空间排列。合成始于激酶抑制剂ABT-869与十二烷二酸（C12连接子）在无水DMF中使用PyBOP和TEA进行缩合，获得中间体。该中间体随后使用HATU和DIPEA与VHL连接剂偶联### 讨论角膜新生血管（CoNV）的管理仍是艰巨的临床挑战。虽然抗VEGF生物制剂（如贝伐珠单抗）被广泛超说明书使用，但其在角膜上的应用常因局部抗体制剂眼部渗透性差而受到阻碍，往往需要侵入性结膜下注射。[30][31] 同样，虽然局部皮质类固醇有效，但其长期效用严重受限于危及视力的副作用，包括### 结论总之，我们开发了一种创新策略，利用cRGD-LNP@V2通过整合素介导的主动靶向将PROTAC分子精确递送至活化的角膜内皮细胞，促进角膜新生血管的非侵入性靶向管理。该方法利用cRGD修饰的脂质体纳米载体，增强了治疗载荷的跨上皮渗透并确保其在病变部位的特异性蓄积。通过克服### 试剂与材料本研究中使用的细胞系包括人脐静脉内皮细胞系EA.hy926（货号TCH-C171-UD），购自海兴生物科技有限公司（中国苏州），以及人角膜上皮细胞系（HCE），购自日本理化学研究所生物资源中心（日本茨城）。所有细胞系均通过短串联重复（STR）鉴定进行身份认证，并常规检测支原体污染。胎牛血清（FBS；货号A5256701）、胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS；货号### CRediT作者贡献声明**黄彩红：** 指导、资金获取。**韩毅：** 写作-审阅与编辑、指导、资金获取、概念构思。**胡佳月：** 指导、资金获取。**马盼琴：** 指导、资金获取。**魏明艳：** 验证、方法学、数据整理。**关文颖：** 验证、方法学、数据整理。**刘祖国：** 指导、资金获取、概念构思。**冯凯：** 写作-审阅与编辑、写作-原稿、方法学、调查研究、数据### 数据可用性数据可根据要求提供。## 利益冲突声明? 作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本论文所报告的工作。## 致谢F.K.、M.W.和W.G.对本工作贡献相同。作者感谢**中国国家自然科学基金**（项目编号82271054、82530034，ZL；项目编号82401321，YH）、**湖南省科技创新计划**（项目编号2025RC3195，YH）、**中国博士后科学基金**（项目编号2023M741608，YH）、**福建省自然科学基金**（项目编号2023J01012，CH）、**湖南省自然科学基金**（项目编号提供的支持。Ke Feng | Mingyan Wei | Wenying Guan | Bing Yan | Shinan Wu | Xiaodong Chen | Jiaoyue Hu | Panqin Ma | Caihong Huang | Yi Han | Zuguo Liu