一种变构可重构代谢酶水凝胶用于自适应肿瘤代谢免疫疗法

《Biomaterials》：An allosteric reconfigurable metabzyme hydrogel for adaptive tumor metabolic immunotherapy

　　摘要 术后肿瘤复发仍是重大临床挑战，因为手术诱导的代谢失调会形成以高血糖、乳酸积累、NADH升高和低氧为特征的免疫抑制微环境。尽管催化NADH氧化可直接抑制乳酸生成，但目前的NADH氧化酶（NOX）模拟催化剂受限于刚性催化界面，难以实现高效的电子传递过程。本文报道了一种别构可重构代谢酶水凝胶，用于术后复发的适应性代谢免疫治疗。受诱导契合酶催化机制启发，我们设计了一种锰掺杂氧化钼（Mn-MoO?）代谢酶，其亚稳态高熵晶格可在NADH触发下发生界面重构，同步实现质子耦合电子转移（PCET）并通过协同的Mn-O-Mo和Mn-O-Mn传递路径加速电荷流动。该水凝胶联合雷德宁A，进一步放大氧化应激，抑制糖酵解通量并促进线粒体DNA泄漏，从而激活cGAS-STING通路。在模拟术后高糖高乳酸微环境的模型中，该水凝胶通过使乳酸降低5.84倍、STING磷酸化增强5.76倍，驱动强效抗肿瘤免疫反应，有效实现94.35%的复发抑制并显著抑制转移。本研究建立了底物响应的别构代谢酶，实现了酶催化柔性与金属催化的桥梁连接，为克服代谢驱动的免疫抵抗并实现术后肿瘤的持久控制提供了变革性策略。引言 恶性肿瘤仍是主要治疗挑战，手术切除始终是临床管理的基石[1]。然而，术后癌症复发持续构成重大障碍，这主要由严重手术诱导的代谢失调导致的术后免疫监视功能受损所驱动[2]，[3]，[4]。手术过程中局部血管的必然中断引发急性缺血和低氧应激，导致缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）持续稳定并加速向有氧糖酵解的深刻转变[5]。因此，局部乳酸积累、细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）升高、氧气（O?）供应受限以及谷胱甘肽（GSH）缓冲作用过度增强共同加剧了残留肿瘤病灶内的术后代谢应激，最终建立了深度免疫抑制微环境[6]，[7]。事实上，激活环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）通路是调动先天性和适应性抗肿瘤免疫并建立长期免疫记忆的关键策略，从而降低复发风险[8]，[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，可使用多种激动剂，包括内源性环状二核苷酸（CDNs）[15]及其合成衍生物、非核苷小分子[16]以及含氨苯并咪唑类似物[17]。然而，该信号轴受到代谢交互作用的深刻破坏：乳酸积累驱动抑制性的cGAS乳酸化修饰[18]，[19]，同时高血糖激活的葡萄糖/NSUN2/3'-修复外切核酸酶2（TREX2）信号通路限制了细胞质双链DNA（dsDNA）的积累，有效消除了STING激活所必需的关键触发因子[20]。总体而言，这些协同的代谢限制将cGAS-STING轴锁定在无反应状态，从而抑制系统性免疫激活并削弱治疗效果[21]。为恢复被抑制的免疫功能，靶向NADH氧化已成为一种在代谢源头截断乳酸生物合成的有吸引力策略[22]。与乳酸转运阻断或消耗性方法（常因代谢可塑性、糖酵解反弹或氧化应激而失效）[23]，[24]不同，NADH耗竭直接消除了乳酸产生的热力学驱动力。内源性NADH氧化由巨大的膜结合复合物I催化，其结构不对称性和多亚基复杂性使其无法作为模块化工具使用，而细菌NADH氧化酶（NOX）同源物则常受限于固有的热不稳定性及次优催化周转率[25]，[26]。迄今为止，人们投入了大量精力开发NOX模拟纳米酶，主要包括贵金属（如金、铂）纳米颗粒（NPs）[27]，[28]、碳基纳米材料（如石墨烯、碳点）以及过渡金属氧化物/硫化物（如二氧化锰（MnO?）、五氧化二钒（V?O?）、二硫化钼（MoS?））纳米颗粒[29]，[30]。在机制上，NADH的氧化脱氢是一个复杂的级联过程，涉及复杂的氢负离子提取、质子耦合电子转移（PCET）以及催化剂内部的后续电荷传递[31]。然而，主要挑战在于NADH缓慢激活与后续终端氧还原之间的动力学失配，这是由于刚性纳米界面导致吸附效率低、PCET势垒高且缺乏动态电子传递路径，从而限制了整体仿生周转率[32]。受自然酶系统中诱导契合范式的启发——底物结合触发构象变化以优化活性位点几何结构并降低活化能[33]——我们假设，工程化别构响应的原子配位环境可将纳米酶催化从刚性静态吸附转变为动态诱导契合模式，从而克服固有的动力学瓶颈。在该设计中，高构型熵晶格可能通过强金属-底物相互作用切断桥键，实现底物触发的界面重构，生成灵活的活性位点以匹配过渡态，降低PCET势垒，并通过协同的双传递路径加速电子流动，实现高效的催化周转。基于这一分子原理，我们进一步提出将这些自适应原子中心整合到水凝胶架构中，可调控底物可及性和别构代谢酶重构，实现按需催化，从而为重新编程手术放大的代谢-免疫失调提供稳健且模块化的策略。为验证该概念，本文开发了一种别构可重构代谢酶水凝胶（命名为RMnG），用于术后复发的适应性代谢免疫治疗。受诱导契合酶催化机制启发，我们通过氧化钼（MoO?）框架重构[34]，[35]和锰（Mn）诱导的Jahn-Teller畸变[36]，[37]，设计了锰掺杂氧化钼（Mn-MoO?）代谢酶（图1A）。与低掺杂量相比，Mn-MoO?代谢酶利用高熵畸变晶格进行底物诱导的别构重构，其中桥键断裂优化了活性位点几何结构，促进质子-电子耦合，并通过协同的Mn-O-Mo和Mn-O-Mn传递路径加速电荷流动，最终提高催化效率（图1B）。值得注意的是，Mn-MoO?代谢酶的催化效率（K_cat）是天然嗜热球菌NOX（TtNOX）[26]的2.96倍。该代谢酶表现出pH依赖性催化切换特性，在酸性条件下表现出协同的过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化氢酶（CAT）样活性，以促进氧化性DNA损伤和cGAS-STING激活，而在生理pH下则倾向于CAT主导的催化。此外，作为水凝胶另一关键成分的雷德宁A（RA）通过其丰富的烷基羟基（-OH）促进电子转移以增强代谢酶催化活性，同时通过抑制HIF-1α/葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）轴抑制糖酵解，并促进转录激活反应DNA结合蛋白43（TDP-43）介导的mtDNA泄漏，最终激活cGAS-STING信号。在模拟高糖高乳酸微环境的术后复发模型中，RMnG驱动深刻的代谢重编程——使肿瘤内葡萄糖和乳酸分别降低15.00倍和5.84倍——从而使STING磷酸化增强5.76倍。随后，这种代谢-免疫级联反应触发树突状细胞（DC）成熟和强效CD8? T细胞募集，有效阻止远处转移并以94.35%的抑制率遏制肿瘤复发（图1C）。总之，该仿生别构代谢酶平台通过底物诱导的重构范式实现了酶催化柔性与刚性界面催化的桥梁连接，为自适应重塑肿瘤景观并克服代谢驱动的免疫逃逸提供了变革性框架。章节片段 原子尺度配位工程优化NOX模拟动力学 免疫刺激性Mn原子在水热条件下被纳入MoO?基质中[38]，制备出Mn-MoO?纳米颗粒，记为NPs-1、-2、-3和-4，初始Mn与Mo前体摩尔比分别为0.125:1、0.25:1、0.5:1和1:1（图2A和图S1）。我们系统研究了不同Mn掺杂比例对类酶活性的影响。首先，随着Mn掺杂比例逐步增加，Mn-MoO?纳米颗粒的NOX样催化性能是结论 总之，本研究提出了一种别构可重构代谢酶水凝胶，为术后癌症管理实现了自适应肿瘤代谢免疫治疗。通过将Mn原子作为别构驱动因素整合到柔性MoO?晶格中，我们建立了一种受自然诱导契合范式启发的NADH触发的别构重构机制。随着Mn掺杂比例增加，1:1的Mn/Mo构型通过诱导动态材料 所有试剂和溶剂均购自商业渠道，未经进一步纯化。双乙酰丙酮二氧合钼(VI)（MoO?(acac)?）、锰(III)乙酰丙酮（Mn(acac)?）、油酸（OA，工业级，90%）、十六胺、1-辛烯和TMB购自美国Sigma-Aldrich Co., Ltd.。β-GP、NADH和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）购自中国阿拉丁工业有限公司。壳聚糖（CS）（脱乙酰度≥95%）和乙酸CRediT作者贡献声明 **Lei Sun：** 方法论。 **Yupei Miao：** 方法论。 **Bo Zhang：** 方法论。 **Jie Wang：** 方法论。 **Daishun Ling：** 撰写–审阅与编辑，监督，概念化。 **Fangyuan Li：** 撰写–审阅与编辑，监督。 **Xi Hu：** 撰写–审阅与编辑，撰写–原稿，监督，概念化。 **Yuhan Yang：** 方法论。 **Bangzhen Hong：** 撰写–原稿，方法论。 **Peng He：** 方法论数据可用性声明 支持本研究结果的数据可通过合理要求向通讯作者获取。利益冲突声明 ? 作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。致谢 本研究得到国家自然科学基金（32422045、32671746、52401016）、安徽省高校青年科学基金项目（2024AH030033）、"常青"计划重点优先研究项目（CQT20250103）、安徽省青年拔尖人才特殊支持计划、安中学者优秀人才计划、上海市卫健委中医药研究项目（2024PT009）和"曙光"计划