无配体烷基修饰壳聚糖纳米颗粒优先被小胶质细胞内化并递送姜黄素以抑制细胞因子释放

《Biomaterials Advances》：Ligand-free alkyl-modified chitosan nanoparticles are preferentially internalized by microglia and deliver curcumin to suppress cytokine release

　　

摘要专业翻译 胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM）是最常见且侵袭性最强的中枢神经系统恶性肿瘤，其肿瘤微环境中肿瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞（tumor-associated microglia/macrophages, TAMs）可促进肿瘤进展。本研究旨在开发一种无需配体修饰即可优先靶向小胶质细胞的纳米递药系统（drug delivery system, DDS），用于递送姜黄素以抑制炎症性细胞因子释放。研究人员将低分子量壳聚糖（chitosan, Cs）与异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）偶联，并通过丁基缩水甘油醚进行疏水性烷基修饰，采用离子凝胶化法制备了丁基壳聚糖纳米颗粒（butyl-chitosan nanoparticles, butyl-CsNPs）及未修饰的壳聚糖纳米颗粒（CsNPs）。动态光散射（dynamic light scattering, DLS）表征显示，丁基化修饰使纳米颗粒粒径增大2.7倍，但butyl-CsNPs在小胶质细胞中的摄取量显著高于CsNPs。研究在脑内皮细胞（hCMEC/D3）、原代大鼠小胶质细胞及SIM-A9小胶质细胞系中定量评估了纳米颗粒的摄取效率，结果表明表面疏水性对细胞摄取的促进作用超过了粒径增大的不利影响。在SIM-A9细胞与U87胶质瘤细胞的共培养体系中，无配体修饰的butyl-CsNPs表现出对小胶质细胞的优先摄取。姜黄素负载实验表明，包载姜黄素的butyl-CsNPs（C-butyl-CsNPs）在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）激活的SIM-A9细胞中表现出较低的细胞毒性，并能显著抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和白介素-6（interleukin-6, IL-6）的释放。研究结论表明，烷基化修饰赋予壳聚糖纳米颗粒表面疏水性，使其无需配体修饰即可被小胶质细胞优先内化，为GBM的免疫微环境调控提供了一种具有临床应用潜力的纳米递药策略。

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一、研究背景与科学问题

胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM）是中枢神经系统最常见且最具侵袭性的恶性肿瘤，其高度异质性和复杂的肿瘤微环境是导致患者预后极差的关键因素。在GBM的肿瘤微环境中，肿瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞（tumor-associated microglia/macrophages, TAMs）占据肿瘤组织中近半数的细胞比例，这些免疫细胞被肿瘤细胞招募后，通过释放抗炎细胞因子和促血管生成因子，促进免疫抑制和肿瘤血管生成，从而支持肿瘤的生长与侵袭。与多数实体瘤不同，GBM在免疫学上被视为“冷肿瘤”，淋巴细胞浸润水平低，而小胶质细胞则是其中最主要的免疫细胞群体。在脑损伤或肿瘤等病理条件下，小胶质细胞被激活并极化为M1表型，释放活性氧（reactive oxygen species, ROS）、一氧化氮（nitric oxide, NO）以及白介素-6（interleukin-6, IL-6）等促炎细胞因子，进而刺激胶质瘤的侵袭能力。

GBM治疗面临的核心挑战是血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的存在。BBB由脑微血管内皮细胞通过连续紧密连接（tight junctions, TJs）构成，并表达P-糖蛋白等外排转运体，严格限制大多数治疗药物进入脑实质。尽管GBM中BBB发生局部破坏形成血脑肿瘤屏障（blood-brain tumor barrier, BBTB），但该屏障的破坏在空间上具有高度异质性，部分肿瘤区域仍位于完整的BBB之后，因此单纯依赖通透性增加无法实现有效的药物递送。

纳米材料作为药物递送系统（drug delivery system, DDS）在增强药物生物利用度和稳定性方面展现出广阔前景。然而，现有的靶向TAMs策略面临多重挑战：基于配体的靶向策略效率低下，因为小胶质细胞特异性标志物如P2RY12和TMEM119在TAMs中表达下调；脂质体包载氯膦酸盐虽可清除小胶质细胞，但会无差别地清除所有吞噬细胞。此外，纳米颗粒的理化性质——包括粒径、表面电荷和表面修饰——决定了其穿越BBB的能力，而正电荷纳米颗粒在体内会吸附白蛋白等负电荷血浆蛋白形成蛋白冠（protein corona），掩盖表面配体并改变体内分布。因此，开发一种无需配体修饰即可精准靶向小胶质细胞的纳米递药系统，成为GBM免疫治疗领域亟待解决的科学问题。

二、研究内容与主要结论

针对上述问题，研究人员设计并开发了一种基于烷基化修饰壳聚糖的无配体纳米递药系统。壳聚糖（chitosan, Cs）是一种由β-(1→4)连接的D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺单元组成的天然阳离子多糖，其聚阳离子表面赋予其黏膜黏附等特性，且可通过与三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate, STPP）的离子交联形成纳米颗粒。研究人员将低分子量壳聚糖与丁基缩水甘油醚反应，引入疏水性丁基烷基链，同时偶联异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）用于追踪纳米颗粒的细胞摄取行为。

研究在体外水平系统评估了丁基壳聚糖纳米颗粒（butyl-CsNPs）和未修饰壳聚糖纳米颗粒（CsNPs）在脑内皮细胞、原代大鼠小胶质细胞和SIM-A9小胶质细胞系中的摄取效率，并在SIM-A9细胞与U87胶质瘤细胞的单培养和共培养体系中比较了纳米颗粒的摄取选择性。进一步地，研究人员将姜黄素负载于纳米颗粒中，评估了包载姜黄素的纳米颗粒对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）激活的SIM-A9细胞释放TNF-α和IL-6的抑制效果。

研究得出的核心结论是：丁基化修饰赋予壳聚糖纳米颗粒表面疏水性，使butyl-CsNPs尽管粒径增大了2.7倍，其在小胶质细胞中的摄取量仍显著高于CsNPs，表明表面疏水性对细胞摄取的促进作用超过了粒径增大的不利影响。在共培养体系中，无配体修饰的butyl-CsNPs表现出对小胶质细胞的优先摄取，而包载姜黄素的butyl-CsNPs在抑制LPS激活的小胶质细胞释放TNF-α和IL-6方面效果显著，且细胞毒性低于游离姜黄素。该研究的重要意义在于，提供了一种不依赖配体修饰即可实现小胶质细胞优先靶向的纳米递药策略，为GBM免疫微环境调控开辟了新途径。

三、关键技术与方法

研究人员采用的主要技术方法包括：通过碱化处理和丁基缩水甘油醚反应合成丁基壳聚糖，利用核磁共振氢谱（¹H NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征其化学结构和取代度；采用离子凝胶化法，以壳聚糖与STPP按5:1的质量比制备纳米颗粒，通过动态光散射（dynamic light scattering, DLS）测定粒径和多分散指数（polydispersity index, PDI），使用扫描电子显微镜（SEM）观察纳米颗粒形态；通过紫外分光光度法测定姜黄素的包封率（encapsulation efficiency, EE）和载药量（loading capacity, LC）；利用FITC标记聚合物，通过荧光检测定量纳米颗粒的细胞摄取；采用Transwell体系构建基于hCMEC/D3细胞的体外BBB模型；使用台盼蓝（trypan blue, TB）淬灭技术区分细胞表面吸附与胞内摄取；通过网格蛋白介导内吞（clathrin-mediated endocytosis, CME）通路抑制实验探究摄取机制。细胞来源方面，hCMEC/D3细胞购自Cytion，U87细胞来自德蒙福特大学，SIM-A9细胞购自BioCat，原代大鼠小胶质细胞取自出生后14天的Sprague-Dawley大鼠。

四、研究结果

4.1 丁基壳聚糖的合成与表征

通过碱化处理和丁基缩水甘油醚反应成功合成了丁基壳聚糖，¹H NMR光谱证实丁基基团成功接枝到壳聚糖骨架上，FT-IR光谱进一步确认了化学修饰的成功。FITC标记效率通过荧光光谱法进行了定量测定。

4.2 纳米颗粒的制备与理化性质表征

离子凝胶化法制备的CsNPs和butyl-CsNPs均呈现规则的球形形态。DLS测定结果显示，butyl-CsNPs的粒径比CsNPs增大约2.7倍，但两种纳米颗粒均具有可接受的PDI值，表明粒径分布较为均一。姜黄素负载实验表明，butyl-CsNPs对姜黄素具有较高的包封率和载药量，且在pH 5.5条件下表现出缓释行为。

4.3 纳米颗粒在脑内皮细胞和小胶质细胞中的摄取

在hCMEC/D3脑内皮细胞、原代大鼠小胶质细胞和SIM-A9细胞中定量评估了纳米颗粒的摄取效率。结果显示，尽管butyl-CsNPs粒径更大，但其在三种细胞中的摄取量均显著高于CsNPs，表明表面疏水性是驱动细胞摄取的主导因素，其作用超过了粒径增大的不利影响。

4.4 LPS激活和摄取机制研究

在LPS激活的SIM-A9细胞中，butyl-CsNPs的摄取进一步增强。网格蛋白介导内吞通路抑制实验表明，抑制CME通路后纳米颗粒摄取显著减少，提示CME是butyl-CsNPs进入小胶质细胞的主要途径之一。台盼蓝淬灭实验确认了纳米颗粒的荧光信号主要来源于胞内摄取而非细胞表面吸附。

4.5 共培养体系中的摄取选择性

在SIM-A9细胞与U87胶质瘤细胞的共培养体系中，butyl-CsNPs表现出对小胶质细胞的显著优先摄取，而CsNPs的摄取选择性不明显。这一结果表明，无配体修饰的butyl-CsNPs天然具有小胶质细胞靶向偏好，无需额外的配体修饰即可实现细胞类型选择性递送。

4.6 姜黄素负载纳米颗粒的抗炎效果

包载姜黄素的butyl-CsNPs（C-butyl-CsNPs）对SIM-A9细胞的毒性低于游离姜黄素，且在LPS激活条件下，C-butyl-CsNPs能显著抑制TNF-α和IL-6的释放，表明该纳米递药系统可在降低药物毒性的同时有效发挥抗炎作用。

五、讨论与结论

研究讨论指出，GBM中TAMs的小胶质细胞特异性标志物表达下调，导致基于配体的靶向策略效率有限。本研究通过烷基化修饰赋予纳米颗粒表面疏水性，利用小胶质细胞对疏水性颗粒的天然吞噬偏好，实现了无需配体修饰的细胞选择性递送。表面疏水性对细胞摄取的影响超过了粒径因素，这一发现为纳米颗粒的设计提供了重要参考。姜黄素作为疏水性多酚类化合物，其抗炎活性受限于水溶性和生物利用度低的问题，而丁基链提供的疏水口袋有效解决了姜黄素的负载难题，同时降低了药物的非特异性毒性。

研究结论表明，无配体烷基修饰的壳聚糖纳米颗粒能够被小胶质细胞优先内化，并有效递送姜黄素以抑制LPS激活的TNF-α和IL-6释放。该策略为GBM的免疫微环境调控提供了一种简化的纳米递药方案，避免了配体修饰的复杂性和蛋白冠遮蔽问题，具有潜在的临床转化价值。