《Bioorganic Chemistry》：Identification of narcissoside from
Anoectochilus roxburghii as an alcohol dehydrogenase inhibitor with protective effects against ethanol-induced HepG2 cell injury
编辑推荐：
•整合筛选与HSCCC技术从A. roxburghii中鉴定出水仙苷。•水仙苷通过混合型机制可逆地抑制ADH。•水仙苷与ADH结合，保护HepG2细胞免受乙醇损伤。引言酒精代谢是酒精相关肝损伤起始与进展过程中的一个核心生化过程[1]、[2]、[3]。在肝细胞中，乙醇主要通过醇
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整合筛选与HSCCC技术从A. roxburghii中鉴定出水仙苷。
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水仙苷通过混合型机制可逆地抑制ADH。
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水仙苷与ADH结合，保护HepG2细胞免受乙醇损伤。
引言
酒精代谢是酒精相关肝损伤起始与进展过程中的一个核心生化过程[1]、[2]、[3]。在肝细胞中，乙醇主要通过醇脱氢酶（ADH）依赖的途径被氧化为乙醛，同时伴随着NAD+被还原为NADH[1]、[2]、[4]。乙醛是一种高度活泼的中间产物，可扰乱细胞氧化还原稳态、线粒体功能、炎症信号及细胞存活[1]、[2]、[5]。此外，过量摄入乙醇还可激活微粒体乙醇氧化系统，尤其是CYP2E1，从而进一步增加活性氧（ROS）的产生[4]。因此，乙醛蓄积和氧化应激均参与乙醇诱导的肝细胞损伤进展[5]、[6]。
调节ADH活性可能影响乙醇向乙醛的转化速率，从而改变乙醛暴露水平和细胞氧化还原稳态[1]、[2]、[7]。然而，对直接抑制ADH的做法应谨慎解读，因为ADH活性降低也可能延缓乙醇清除并提高其他乙醇代谢途径的相对贡献[1]、[2]。因此，针对ADH靶点的化合物的生物学意义应结合其抗氧化能力与整体细胞保护效应加以评估。利用电泳、光谱、酶学及分子手段，天然产物，尤其是类黄酮，已作为酵母ADH结合物或抑制剂被筛选过[8]、[9]、[10]。然而，仅凭酶学证据并不能确立抗氧化或细胞保护效力，而仅有抗氧化活性也无法证明其对乙醇代谢的直接作用。因此，整合这些互补性质的筛选策略可能为识别具有双重功能、具有肝脏保护潜力的候选化合物提供更具生物学相关性的方法。
Anoectochilus roxburghii是一种传统药食同源植物，含有多种生物活性成分[11]、[12]。在这些成分中，多糖和开运竹苷受到了大量的药理学关注[11]、[13]、[14]、[15]。开运竹苷在自身免疫性肝炎、肝纤维化炎症及酒精相关肝损伤的实验模型中表现出免疫调节和肝脏保护活性[13]、[14]、[15]。相比之下，其他小分子成分对乙醇相关的代谢和细胞损伤的作用仍未得到明确界定。水仙苷最近被确定为A. roxburghii中的一种主要类黄酮芦丁苷，参与其生物合成的特异性UDP-糖基转移酶也已被鉴定[12]。然而，水仙苷与ADH的相互作用以及其对抗乙醇诱导的肝细胞损伤的保护作用尚未得到系统研究。
在本研究中，我们建立了一种整合筛分策略，将微分部分化（MF）、亲和超滤（AU）与HPLC相结合，用于鉴定A. roxburghii中兼具抗氧化活性和ADH结合潜力的成分。通过该策略，水仙苷被确认为一个极具前景的候选物，并随后通过HSCCC进行分离。进一步利用酶动力学、多光谱分析、分子对接和分子动力学模拟表征其与ADH的相互作用。随后在乙醇损伤的HepG2细胞模型中评估其保护效果。本研究提供了新证据表明，水仙苷是一种可抑制ADH并在体外减轻乙醇诱导的肝细胞损伤的天然类黄酮苷。
章节摘要
试剂与仪器
分析级甲醇（CAS号67–56-1）、石油醚（CAS号8032-32-4）、乙醇（CAS号64–17-5）、乙酸乙酯（CAS号141–78-6）、正丁醇（CAS号71–36-3）、甲酸（CAS号64–18-6）及正己烷（CAS号110–54-3）均购自泰坦科学有限公司（中国上海）。过硫酸钾（K?S?O?；CAS号7727-21-1）和磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4；货号P301982）购自阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。水仙苷
整合MF-AU-HPLC筛选鉴定I峰为双重活性候选物
氧化应激和ADH介导的乙醇氧化均参与乙醇诱导的肝细胞损伤。因此，将MF-HPLC活性剖析与AU-HPLC整合，以优先选择兼具自由基清除能力和明显ADH结合活性的成分。如图1所示，14个色谱峰的ABTS自由基清除率超过20%，其中7个峰超过40%。在这些峰中，I峰的自由基清除活性最强，达到83.0%。
结论
本研究建立了一种整合的MF-AU-HPLC-HSCCC策略，用于筛选、分离并表征A. roxburghii中的生物活性成分。水仙苷被鉴定为一种同时具有ABTS自由基清除活性和明显ADH结合活性的成分，并随后通过HSCCC进行分离。酶动力学分析支持其混合型抑制机制，并提供了与可逆抑制相符的动力学证据。荧光光谱提示水仙苷引起
CRediT作者贡献声明
史琦文（Qiwen Shi）：撰写—初稿撰写、研究方法、调查研究、资助获取。姜伟臻（Weizhen Jiang）：调查研究。张雨洁（Yujie Zhang）：调查研究。白佳怡（Jiayu Bai）：调查研究。张辉（Hui Zhang）：研究方法、调查研究。周爱春（Aicun Zhou）：资源、调查研究。卢晨飞（Chenfei Lu）：资源、调查研究。邵青松（Qingsong Shao）：撰写—审阅与编辑、指导、资源。童胜强（Shengqiang Tong）：撰写—审阅与编辑、指导、项目管理、资助获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文所报告的工作。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（22478347；21978266）、浙江省"尖兵""领雁"研发攻关计划（2025C04034）、浙江省"尖兵"和"领雁"重点研发攻关计划（2026C02A1027）、浙江省自然科学基金（LBY22H280004）、浙江省高校基本科研业务费（2024TD003）、国家重点实验室等项目的资助。
史琦文|姜伟臻|张雨洁|白佳怡|张辉|周爱春|卢晨飞|邵青松|童胜强
