新型短叶木香素A衍生物的设计、合成及其抗肿瘤生物活性评价

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis and biological evaluation of novel Brevilin a derivatives as antitumor agents

　　

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  合成了一系列新型 brevillin A（BA）的B环和C环衍生物。
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  阐明了来自Centipeda minima的倍半萜内酯类化合物的抗肿瘤构效关系（SAR）。
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  BA衍生物在A549细胞中诱导凋亡而非细胞周期阻滞
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  BA衍生物通过直接与STAT3结合来发挥作用。
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  BA衍生物在体内表现出抗肿瘤活性且无明显毒性。

引言

Centipeda minima（L.）A. Braun & Asch（C. minima）是一种广泛分布于东亚和东南亚的药用草本植物。它传统上被用于治疗各种疾病，包括鼻炎、咳嗽、头痛、腹泻、哮喘和鼻咽癌（NPC）。近期研究表明，C. minima在乳腺癌、结直肠癌、鼻咽癌和非小细胞肺癌（NSCLC）中表现出令人前景的抗癌效果[1]、[2]、[3]。倍半萜内酯是C. minima中的主要活性成分，具有经充分记载的抗肿瘤活性[4]。其中，BA是最丰富的倍半萜内酯之一，占植物干重的0.1%以上[5]、[6]、[7]。既往报道表明，BA主要通过诱导细胞周期阻滞以及靶向癌症细胞中的信号转导子和转录激活因子3（STAT3）和S期激酶相关蛋白1（Skp1）来抑制肿瘤生长[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。STAT3抑制是开发临床抗癌药物的一个有前景的策略。与正常细胞中受到严格调控不同，STAT3在多种癌症类型中呈组成性激活状态。这种异常激活驱动了关键的致癌过程，包括增殖、细胞周期进展、凋亡、血管生成、转移和免疫逃逸[16]、[17]、[18]。因此，靶向STAT3的药物候选物展现了良好的安全性特征和强大的抗肿瘤活性[19]、[20]。

BA已被确立为多种癌症类型中强效的STAT3抑制剂[2]、[3]、[5]。它靶向结直肠癌-肝星状细胞（CRC-HSCs）相互作用中的VEGF-IL6-STAT3轴，从而在体外和体内显著抑制了结直肠癌肝转移和肿瘤生长[10]。使用生物素标记的BA进行蛋白质微阵列筛选（16,368种蛋白质）确定了STAT3为其直接结合靶点。BA/STAT3相互作用的计算模型显示，该化合物在STAT3的Src同源-2（SH2）结构域处结合，与残基Ser611、Ser613和Arg609形成氢键。为验证SH2结构域及这三个残基在BA结合中的关键作用，构建了表达SH2缺失型STAT3以及S611/S613/R609突变型STAT3的质粒。野生型STAT3对生物素标记的BA表现出高结合亲和力，而SH2结构域的缺失或S611/S613/R609的突变显著降低了结合亲和力[13]。另一项独立研究通过分子对接预测了结合相互作用，并进一步使用表面等离子体共振（SPR）分析进行了验证。PyMOL中的对接模拟显示，BA与残基Arg688、Leu577和Ile576形成氢键。LIGPLOT分析显示，除BA与Ile576、Leu577和Arg688之间的稳定氢键外，还与残基Tyr686、Ser649、Leu645、Leu579和Tyr575存在外围疏水相互作用。为进一步确认BA与STAT3的直接结合，进行了SPR实验，观察到剂量依赖性的结合曲线，平衡解离常数（KD）约为0.0124 μM[21]。尽管BA已被确立为STAT3抑制剂，但其效力受限于微摩尔级别的活性，而临床STAT3抑制剂通常在纳摩尔级别发挥作用。此外，BA的选择性特征仍有待进一步优化，因为它已被报道可靶向多种非STAT3蛋白，包括Skp1、SCF E3泛素连接酶、NF-κB以及PI3K/Akt信号通路。

鉴于C. minima中倍半萜内酯类化合物含量高且生物活性广泛，它们引起了人们在抗癌药物开发方面的极大兴趣[3]、[22]。然而，作为源自C. minima的特征性化学骨架，BA的抗肿瘤衍生物化及其构效关系研究仍相对有限。Minimolide A是BA的天然A环类似物，对CNE细胞的IC₅₀值为20.30 μM[23]。为研究BA的抗肿瘤机制，通过硫醇连接将生物素标签偶联至BA的烯酮部分（Bio-6-OAP），其对H1975细胞的IC₅₀为40 μM[13]。为系统地探索BA的构效关系，合成了一系列A环修饰的BA类似物[24]。对A环烯酮部分的烯烃或羰基进行还原均导致抗增殖活性完全丧失。在A环烯酮的α-位引入新的取代基也导致活性降低或完全消失。倍半萜内酯类化合物通过烷基化中心发挥其生物活性，该中心通过Michael加成与靶蛋白上的亲核巯基残基发生共价反应[25]。上述所有A环类似物均破坏了BA骨架中的共轭环戊烯酮部分或增加了该活性中心周围的位阻，从而导致活性降低。

一般来说，脂溶性的增加有助于穿透细胞膜，从而改善生物活性。已发表的研究表明，一系列BA的天然类似物在C-6酯侧链方面存在差异。缺乏侧链的Plenolin对CNE细胞的IC₅₀为18.90 μM[23]。Arnicolide C对CNE-2细胞的IC₅₀为4.64 μM[26]。具有末端烯烃部分侧链的Arnicolide D在不同细胞系中表现出广泛的IC₅₀值（0.99至47.84 μM）[3]、[26]。这种变异性可能源于末端烯烃部分与非靶标亲核位点之间的副反应。相比之下，BA在各种肿瘤细胞系中的IC₅₀值范围为3.5至17.7 μM[3]。Microhelenalin B对HeLa、HCT-116和HepG2细胞的IC₅₀值分别为2.4、7.3和> 10 μM。具有稍大碳链的Arnicolide B对相同细胞系的IC₅₀值分别为5.5、7.2和> 10 μM[6]。对天然类似物的分析表明，C-6位适当大小的酯侧链可能增强BA骨架的抗肿瘤活性，从而将这一位点确定为结构优化的有前景目标。

如前所述[24]，合成了一系列在C-11位具有不同官能团的C环衍生物以研究BA的构效关系。对这些衍生物细胞活力抑制活性的评估表明，BA-9（IC₅₀ = 6.24 μM）和BA-10（IC₅₀ = 6.39 μM）对A549细胞的活性相较于BA（IC₅₀ = 10.09 μM）有所增强。倍半萜内酯的构效关系分析表明，C环衍生化在空间上远离BA骨架的A环活性中心，因此引入的位阻最小，不会干扰共轭环戊烯酮部分的结合或反应性。值得注意的是，BA-9和BA-10分别具有刚性的取代苯环和共轭末端烯烃部分，与具有柔性链的衍生物（BA-11、BA-12）相比表现出更优的抗增殖活性。这表明C环酯侧链有可能作为设计双功能衍生物的新活性中心。

基于上述发现（图1），为系统地探索源自C. minima的BA骨架的构效关系，我们设计并合成了一系列B环和C环衍生物。为此，制备了26种新型衍生物。所有目标化合物均通过¹H NMR、¹³C NMR和HRMS进行了表征。所有合成化合物均进行了细胞活力抑制活性筛选以总结构效关系。随后选取最具活性的代表性化合物c8评估其对细胞增殖、细胞迁移、细胞周期和凋亡的影响。其分子靶点通过Western blot（WB）和细胞热位移分析（CETSA）进行了鉴定。此外，在A549异种移植小鼠模型中验证了其体内抗肿瘤活性，并通过血液生化标志物和肝、肾组织切片的苏木精-伊红（H&E）染色评估了其初步安全性特征。

章节摘要

BA衍生物的合成

为合成BA衍生物，对从C. minima中提取的BA进行酸水解以获得立体化学完整的核心结构。该核心结构随后与适当的酰氯反应，得到B环衍生物（b1-b13，方案1）。

在方案2中，我们优化了文献报道的方法以获得C-11位的醛醇缩合产物，随后与相应的酰氯反应以合成C环衍生物（c1-c13）。

鉴于

讨论

天然产物活性骨架的结构修饰是获取新型生物活性分子的一种有前景的策略[25]。由于其多样的药理活性，BA受到了研究人员的极大关注。研究表明，作为BA骨架的烷基化中心，共轭环戊烯酮部分的结构改变或其周围位阻的增加会导致活性降低甚至完全丧失活性[25]、[31]。天然存在的

结论

在本研究中，我们设计并合成了一系列源自C. minima的BA的B环和C环衍生物，从而全面总结和完善了特征性BA活性骨架的抗肿瘤构效关系。本研究证实C环的C-11位是结构衍生化的有前景位点。获得了一系列活性增强的C环衍生物。体外和体内评估均表明，代表性化合物c8是一种更具

化学部分

化学通用方法。除另有说明外，试剂均购自商业供应商且未经进一步纯化直接使用。纯化及反应通过薄层色谱（TLC）在预涂硅胶GF254板上进行监测，斑点在254 nm紫外灯下检测。氢核磁共振（¹H NMR）谱图和碳核磁共振（¹³C NMR）谱图在Bruker AV-400波谱仪上记录（400 MHz和100 MHz）。化学

CRediT作者贡献声明

Liangxi Wen：撰写——初稿，方法学，调查，形式分析。Anqi Liu：可视化，调查，形式分析。Junfeng Li：可视化，调查，形式分析。Ruoting Zhan：项目管理，形式分析。Xu-Kuan Qi：撰写——审阅与编辑，方法学，概念化。Huicai Huang：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（22001048）、广东省珠江人才计划（2017GC010361）和中医湿病国家重点实验室专项基金的资助。

Liangxi Wen|Anqi Liu|Junfeng Li|Ruoting Zhan|Xu-Kuan Qi|Huicai Huang