# 中文标题 利用瑞士阿尔卑斯高山湖泊噬菌体抗性细菌构建具有广谱抗病毒活性的合成微生物群落：噬菌体抗性与病毒灭活的首次关联

《Environmental Science & Technology》：Harnessing Alpine Lake Bacteria for the Development of Synthetic Communities with Broad-Spectrum Antiviral Activity

　　

# 摘要翻译

在水生生态系统中，吞噬性原生生物（phagotrophic protists）和噬菌体（bacteriophages，即感染细菌的病毒）是塑造细菌种群的主要生物因素。然而，阿尔卑斯高山湖泊的极端环境条件和低营养物浓度限制了原生生物的丰度，因此噬菌体可能代表这些生态系统中塑造细菌群落的主要生物因素。研究人员假设，阿尔卑斯高山湖泊细菌种群拥有多样化的抗噬菌体策略，这些策略可用于对抗其他病毒病原体。为评估瑞士高海拔湖泊中具有广谱抗病毒活性（broad-spectrum antiviral activity）的细菌的存在，研究人员对瑞士24个阿尔卑斯高山湖泊开展了采样活动。研究人员评估了两种人类病毒——埃可病毒11型（echovirus 11，E11）和甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）——在湖水中的衰减，并表征了所收集样本中的微生物丰度和代谢多样性（metabolic diversity）。此外，研究人员获得了223株细菌分离株的集合并筛选了噬菌体抗性细菌，以构建合成群落（synthetic communities），该群落对两种受试人类病毒和一种具有商业重要性的植物病毒——马铃薯X病毒（Potato Virus X，PVX）——具有增强的抗病毒活性。这些结果支持了研究人员的假设，并首次揭示了噬菌体抗性与病毒灭活（viral inactivation）之间的关联。研究人员的发现强调了阿尔卑斯高山湖泊作为微生物多样性热点的重要性，其具有尚未开发的生物技术应用潜力。

# 论文解读

## 一、研究背景与问题提出

阿尔卑斯高山湖泊是典型的极端环境生态系统，具有低营养物浓度、低温度、冬季冰覆盖、夏季高紫外线（UV）辐射、短暂的夏季以及冰封期与融冰期之间剧烈的光照变化等特征。尽管条件严苛，这些湖泊仍孕育着高度多样的细菌群落，它们在生态系统的物质循环和能量流动中发挥着核心作用。

在水生生态系统中，吞噬性原生生物的捕食和噬菌体的侵染是塑造细菌种群结构和动态的两个主要生物因素。然而，与低地湖泊相比，阿尔卑斯高山湖泊中原生生物的丰富度和多样性显著偏低，使得原生生物捕食对细菌群落的影响相对有限。由于噬菌体通常对极端环境条件具有高度耐受性，它们很可能是阿尔卑斯高山湖泊中调控细菌群落的主要生物驱动力。噬菌体是水生系统中丰度最高的微生物，据估计其导致了20%至40%的细菌死亡率，并对宿主细菌施加着巨大的选择压力。细菌与噬菌体之间的相互作用是一场持续的、动态的"军备竞赛"：细菌不断进化其免疫系统并发展出抵抗噬菌体感染的多样化机制，而噬菌体则通过频繁突变来对抗细菌的防御。细菌已将这些防御机制编码于基因组中被称为"防御岛"（defense islands）的区域，包括CRISPR/Cas系统（成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白系统）、BREX系统（噬菌体排斥系统）、限制性内切酶介导的DNA降解、细菌程序性细胞死亡以及抗病毒化学分子（如viperin蛋白）的产生等。值得关注的是，细菌与人类的viperin蛋白在结构和功能上具有惊人的相似性，均被用于对抗病毒感染。

气候变化、城市化进程和人口流动性的增加显著提升了新发传染病的风险。病毒病原体由于具有高突变率、庞大的种群数量、极短的世代时间等特点，能够迅速对抗病毒药物和消毒剂产生耐药性。针对快速进化且不断涌现的人类、动物和植物病毒病原体的有效抗病毒分子长期处于匮乏状态。尽管极端环境中的水生生态系统被认为是微生物次级代谢产物的丰富来源，且已有研究表明淡水微生物及其蛋白酶对脊髓灰质炎病毒、埃可病毒12型、轮状病毒SA-11和柯萨奇病毒B5等具有抗病毒活性，但高海拔水生环境作为新型细菌源性抗病毒化合物发现热点的巨大潜力仍然基本未被探索。

## 二、研究目的

基于阿尔卑斯高山湖泊的极端环境条件和噬菌体的高丰度，研究人员提出核心假设：这些环境中的细菌已进化出复杂多样的抗噬菌体防御机制，这些机制可能同样对多种真核生物病毒具有灭活作用。此类共享的抗病毒机制很可能以胞外方式发挥作用（如多糖及其他次级代谢产物），因为尚无证据表明人类或哺乳动物病毒能够进入细菌细胞内。因此，本研究旨在系统探索瑞士阿尔卑斯高山湖泊中细菌群落及其分离株的广谱病毒灭活能力。

## 三、关键技术方法概述

研究人员在瑞士阿尔卑斯山树线以上的8个不同区域对24个高山湖泊开展了采样活动，所有样本于2021年9月至11月间采集。通过定量聚合酶链反应（qPCR）靶向16S rRNA基因、18S rRNA基因和g23基因（编码有尾噬菌体主要衣壳蛋白）分别定量细菌、真核微生物和有尾噬菌体的丰度。利用Biolog EcoPlates碳源代谢微孔板评估各湖泊微生物群落的代谢多样性，并计算Shannon多样性指数。通过LB琼脂培养基从各湖泊水样中分离纯化获得223株细菌分离株，利用16S rRNA基因Sanger测序进行物种鉴定。汇集24个湖泊的噬菌体组分构建"噬菌体混合液"，对每株分离株进行噬菌体敏感性测试，以g23 qPCR定量共培养前后噬菌体滴度变化来区分噬菌体敏感株和抗性株。利用筛选出的抗性菌株构建两个合成群落（各25株）和一个敏感菌株对照群落。对人类病毒（E11和IAV）的灭活通过感染性实验和RT-qPCR评估，以BGMK细胞和MDCK细胞分别测定E11和IAV的感染滴度；对植物病毒PVX和Pepino花叶病毒（PepMV）的灭活通过机械接种烟草植株和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测评估。采用Oxford Nanopore Technologies平台对合成群落进行16S rRNA基因扩增子测序以分析群落组成。

## 四、研究结果

**3.1 瑞士阿尔卑斯高山湖泊的微生物丰度与代谢多样性**

研究人员对24个湖泊的微生物丰度进行了定量分析，发现各湖泊间存在极大的变异性。细菌浓度（16S rRNA基因拷贝数）范围从Lac Bleu（Arolla）的300基因组拷贝/升（gc/L）到Spilsee（Bellwald）的超过10⁸ gc/L。真核生物DNA（18S rRNA基因）丰度从Lac Bleu的100 gc/L到Stellisee和Leisee（Zermatt）的10⁹ gc/L不等。有尾噬菌体（g23基因）浓度在低于10 gc/L至高于10⁷ gc/L之间变化。值得注意的是，Mossjesee、Guggisee、Marjelensee和Salanfe四个湖泊的有尾噬菌体与细菌和真核生物总和的比率分别为0.12、0.15、0.10和0.69，远高于其余20个湖泊的平均比率0.01。其中Lake Salanfe的噬菌体-宿主比率是其他湖泊平均值的60倍。代谢多样性分析显示，Lac Bleu、Petit Aletsch 1和Schwarzsee的Shannon多样性指数最高（均大于3），其微生物群落能够代谢全部六大类碳源（碳水化合物、氨基酸、羧酸、胺类和醇类）。相反，Stellisee和Leisee的代谢多样性最低（Shannon指数小于1），其微生物群落无法利用绝大多数底物。

**3.2 阿尔卑斯高山湖泊微生物群落对人类病毒的抗病毒活性**

研究人员选取了四个噬菌体-宿主比率较高的湖泊（Guggisee、Mossjesee、Marjelensee和Salanfe）和四个比率较低的湖泊（Lac Bleu、Schwarzsee、Small Lac de Vaux和Mittelsee），通过0.8 μm过滤去除原生生物后，在湖水中进行两种结构迥异的人类病毒（E11和IAV）的灭活实验。结果显示，所有受试湖泊中E11的灭活程度均高于IAV，其中8个湖泊中有5个的E11灭活超过1 log₁₀，而IAV在所有湖泊中均灭活约1 log₁₀。Mossjesee湖（一个由冰川融水形成的人工水库）对两种病毒的灭活效果最为显著，孵育7天后E11平均衰减2.17 log₁₀，IAV衰减1.03 log₁₀。Mossjesee湖水中E11的灭活显著高于Salanfe湖（P=0.0387）和Mittelsee湖（P=0.0199）。然而，研究人员未发现病毒灭活程度与噬菌体-宿主比率或湖泊代谢多样性之间的显著相关性。

**3.3 阿尔卑斯高山湖泊蕴藏着对噬菌体感染低敏感性的细菌**

研究人员通过LB琼脂培养基从24个湖泊中共获得223株细菌分离株，各湖泊的分离株数量从4株到19株不等。Guggisee和Oeschinensee产出的分离株数量最多（分别为19株和16株），合计约占总数的15%；Stellisee和Wirbulsee仅各获得4株。为鉴定具有降低的噬菌体敏感性的细菌，研究人员将全部24个湖泊的噬菌体组分（0.22 μm过滤湖水）混合制备"噬菌体混合液"，该混合液包含了大量多样化的噬菌体，理论上能够感染大多数细菌分离株。将223株分离株分别与噬菌体混合液共培养后，通过比较共培养前后的噬菌体滴度（g23 qPCR定量），研究人员鉴定出148株对噬菌体混合液敏感（共培养后噬菌体滴度升高），而75株表现出降低的敏感性（噬菌体浓度降低）。噬菌体抗性细菌比例最高的湖泊为Oeschinensee（9株）、Lac de Vaux（8株）、Leisee（8株）和Lac de Salanfe（8株）。除上述观察外，研究人员未发现噬菌体抗性与湖泊微生物丰度或代谢特征之间的明确相关性。

**3.4 噬菌体抗性合成群落对人类和植物病毒表现出增强的抗病毒活性**

研究人员将筛选的噬菌体抗性菌株组合构建了两个合成群落（群落1和群落3），同时以噬菌体敏感菌株构建了一个对照群落，每个群落均包含25株细菌。将三种群落分别与E11或IAV共孵育4天后，结果显示两个噬菌体抗性群落（群落1和3）对人类病毒的灭活能力显著优于对照群落（P<0.01），而群落1和群落3之间无显著差异。具体而言，合成群落在4天内对E11的灭活约达3 log₁₀，对IAV约达1 log₁₀，均优于此前在湖水中观察到的7天灭活效果（约2 log₁₀衰减）。16S rRNA基因扩增子测序分析群落组成显示，Brevundimonas、Serratia、Pseudomonas和Stenotrophomonas属在三个群落中均有较高相对丰度；Alcaligenes和Microbacterium属仅在群落1和3中存在而在对照群落中缺失。Bacillus属和Staphylococcus属为群落1特有，Allorrhizobium属则为群落3特有且丰度较高。这些属均曾在淡水和高山环境中被鉴定分离，其中部分种类（如Serratia marcescens的蛋白酶和Bacillus subtilis的次级代谢产物）已被报道对植物病毒或RNA病毒具有抗病毒活性。

在植物病毒实验中，研究人员以群落3作为概念验证，测试其对PVX和PepMV的灭活效果。将两种植物病毒分别与群落3或在磷酸盐缓冲液（PBS）中于室温共孵育4天后，机械接种烟草植株，在接种后19天通过ELISA评估病毒感染率。结果显示，PVX单独接种时79%的植株被感染，而与群落3共孵育后感染率骤降至仅1%。相比之下，PepMV在与群落3共孵育后未显示出感染率的降低。这表明群落3虽然具有广谱抗病毒活性，但在不同病毒间的灭活程度存在一定特异性。对照组实验证实了群落3对植株无致病性。

## 五、讨论与结论

本研究开发并成功应用了一种创新策略，从24个瑞士阿尔卑斯高山湖泊的环境样本中筛选噬菌体抗性细菌，进而构建了两个对人和植物病毒具有增强的广谱抗病毒活性的合成细菌群落。研究进一步证实，暴露于极端环境条件下的阿尔卑斯高山湖泊确实蕴藏着具有抗病毒特性的细菌种群，这与研究人员此前在低地湖泊（如日内瓦湖）中的观察结果一致。本文最重要的发现是首次提供了细菌对本地环境噬菌体的抗性与感染不同宿主（人类和植物）的病毒病原体灭活之间存在关联的实验证据，尽管这一关系的具体分子机制仍有待阐明。

研究人员通过评估各群落成员的胞外蛋白酶分泌活性，未发现噬菌体抗性群落与敏感群落在蛋白水解活性方面存在显著差异，表明除了蛋白酶之外，可能还有其他化学、酶学或结构性抗菌机制参与病毒灭活过程。关于合成群落的组成，已鉴定出的多个属（如Pseudomonas、Serratia、Stenotrophomonas、Brevundimonas、Alcaligenes等）均属于γ-变形菌纲或β-变形菌纲，在文献中已有被g23靶向的T4样肌尾噬菌体感染的记载，这支持了本研究中噬菌体敏感性分类的可信度。

除生态学意义外，这些发现对环境生物技术具有重要启示。鉴定具有抗病毒活性的细菌分类群和群落有助于开发基于生物的策略，以增强天然水体和人工水处理系统中病毒的去除效率；对参与病毒灭活的分子机制进行深入表征，则可能导向新型抗病毒酶、代谢产物或胞外产物的发现，在水处理和環境修復领域具有广阔的应用前景。此外，具有增强抗病毒活性的合成群落的成功组装，展示了微生物组工程（microbiome engineering）在定向设计具有定制抗病毒功能的微生物联合体方面的巨大潜力。

研究结论如下：研究人员开发并应用了一种创新策略，从24个瑞士阿尔卑斯高山湖泊的环境样本中构建了两个具有增强的广谱抗病毒活性（针对人类和植物病毒）的合成细菌群落。研究人员进一步证明，暴露于极端环境条件下的阿尔卑斯高山湖泊蕴藏着具有抗病毒特性的细菌种群，这与研究人员此前在低地湖泊（如日内瓦湖）中的观察结果一致。本研究结果首次提供了细菌对本地环境噬菌体的抗性与感染多种宿主的病毒病原体灭活之间存在关联的证据，尽管这一关系的机制基础仍有待阐明。未来的研究将致力于阐明本文所报道的广谱病毒灭活背后的分子机制。