低成本增材制造拉曼光谱仪用于皮肤癌筛查：设计、校准与初步测试

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Design, calibration, and preliminary testing of an additive-manufactured Raman spectrometer for skin cancer screening

　　

摘要专业翻译 设计、校准与初步测试一种增材制造的拉曼光谱仪用于皮肤癌筛查 要点： •一种拉曼光谱仪的构建成本可低于商用设备价格的十分之一。 •该光谱仪易于操作，可将激光束直接对准皮肤病变部位。 •结果表明，该设备能够区分不同类型的皮肤病变。 1.引言 皮肤癌是一种以皮肤细胞不受控制增殖为特征的疾病。恶性皮肤肿瘤的主要类型可分为黑色素瘤（melanoma，形成于黑色素细胞）和非黑色素瘤（其中鳞状细胞癌和基底细胞癌最为常见）。根据世界卫生组织（WHO）下属国际癌症研究机构的数据，全球范围内非黑色素瘤皮肤癌是第五大最常见的确诊恶性肿瘤[1]。在发病率方面，根据WHO全球癌症观察站Cancer Today平台的数据，2022年报告了331,722例新发黑色素瘤皮肤癌病例和123.4万例新发非黑色素瘤皮肤癌病例[2]。 最广泛使用的诊断方法是侵入性的（皮肤活检）。在这方面，准确和早期诊断对于降低发病率至关重要[3]。由于该疾病的主要治疗方式是涉及病变完全切除的手术，位于具有重要美学意义的突出区域（如头颈部）的肿瘤需要仔细分析，始终在尽可能少切除组织的同时追求足够的切缘。由于治疗的有效性与早期检测直接相关，对替代性诊断技术（尤其是非侵入性技术）的需求日益增长。诊断中的主要困难之一出现在区分相似结构时，例如将黑色素瘤与良性色素性病变（如脂溢性角化病）或癌前病变（如良性痣）区分开来。在这方面，Mevorach等人[4]的研究列出了最常见的皮肤肿瘤类型，包括色素性和非色素性、良性和恶性。 多种非侵入性技术可用于辅助皮肤癌诊断，如皮肤镜（dermoscopy）[5]、反射共聚焦显微镜（reflectance confocal microscopy）[6]、光学相干断层扫描（optical coherence tomography）、光声断层扫描和高频超声[7]。此类非侵入性技术的一个例子是拉曼光谱（Raman spectroscopy），这是一种基于物质对光的非弹性散射（拉曼散射）的技术。该技术提供客观的分子指纹，并具有无需样品制备的优点，这对于体内研究尤为理想。此外，拉曼光谱的另一大优点是散射信号不受水干扰的影响，使其非常适合分析生物样品中其他生物分子的信息[8]。 为了测量样品对光的拉曼散射，拉曼光谱仪基本上由三个子系统组成：激发系统、辐射收集系统（中继系统）和辐射检测系统。现代拉曼光谱主要基于激光源，因为其高强度对于产生足够强的拉曼散射以实现可接受的信噪比至关重要[9]。激光波长通过平衡拉曼散射概率与固有干扰信号（如荧光）来确定[9]。辐射收集系统负责捕获指向探测器的散射光锥，并滤除不需要的信号（如瑞利散射产生的信号）[10]。最后，检测系统通常由准直元件、色散元件、聚焦元件和探测器组成，探测器将入射光子转换为电信号以供计算机处理。检测系统组件的选择决定了光谱仪的配置，可以是反射式或透射式。 光谱仪中常用的探测器（如CMOS）在近红外区域往往表现出较低的效率。此外，由于散射强度与λ4成反比，拉曼散射在该范围内较少发生[11]。因此，此类检测系统需要高数值孔径以减轻这些缺点并最大化所需光子入射到相机阵列上。基于Czerny-Turner配置的反射式检测系统，由于使用球面镜，随着数值孔径增大，像差会增加[12]。相比之下，基于透镜的仪器能够实现高数值孔径且不易受这些效应影响[13]。因此，采用类似于[14]所用装置的透镜-光栅-透镜折射式检测系统是合理的，以最小化像差效应。 多项研究集中于使用拉曼光谱信号诊断皮肤癌。其中，一些研究将统计技术或机器学习算法应用于所研究的信号，以区分特定的皮肤病变[15]–[19]。按时间顺序，该研究方向的研究旨在改进信号分类模型。例如，Bratchenko等人[15]采用了偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型。随后，Bratchenko等人[15]通过应用卷积神经网络提高了同一数据集上的分类准确率。其他研究试图通过数据增强来缓解皮肤拉曼光谱数据有限的问题[20]–[22]。该研究方向通过人工数据增强方法的改进而发展。例如，Wu等人[22]应用数据增强技术来缓解皮肤癌拉曼光谱数据的稀缺性，而Wang等人[20]利用与目标数据集不同的数据集采用了对比学习方法。 另一研究方向旨在识别拉曼信号中与生物标志物相关的峰[8]、[23]–[25]。该方向通过实施多种能够在信号中识别生物标志物的技术而推进。例如，Nguyen等人[24]采用生物物理模型从拉曼光谱中提取生物标志物，而Chang等人[25]使用先进的Transformer神经网络模型结合可解释人工智能技术，证明了DNA相关光谱峰在黑色素瘤分类中的相关性。此外，多项研究集中于将拉曼光谱与其他非侵入性技术相结合，以构建稳健的诊断系统[7]、[26]–[30]。关于这一研究方向，时间演变反映了开发稳健的非侵入性多模态技术的努力，其中拉曼光谱发挥着基础性作用。例如，Rimskaya等人[29]将共聚焦拉曼显微镜与光致发光相结合以识别非黑色素瘤肿瘤。此外，Kukk等人[7]指出，为了提供浸润深度和病理生理学数据，拉曼光谱可以与其他非侵入性技术（如光学相干断层扫描（OCT）、光声断层扫描和超声）集成在单个扫描单元中，用于所研究病变的体内3D图像和拉曼光谱采集。这些工作证明了拉曼光谱在区分皮肤病变方面的多功能性、非侵入性和高能力。 低成本设备对于在技术采用方面受严格财务约束的卫生系统来说是一种可行的替代方案。正如巴西国家卫生技术纳入委员会的一份卫生技术评估报告所强调的，高经济影响导致2023年至2025年间统一卫生系统（SUS）中62.7%的技术纳入请求被拒绝[31]。此外，关于黑色素瘤，初级保健环境中的全科医生承担着检测风险因素的主要责任。在该医疗网络中，从识别可疑病变到进行组织病理学检查的平均间隔时间从一个月到超过十二个月不等。事实上，SUS内部的行政障碍和操作延误推迟了近一半患者群体的活检诊断[32]。这些因素凸显了对具有成本效益的皮肤癌诊断支持技术的需求，以最大限度地减少从初次医疗咨询到最终诊断之间的延迟。 本研究旨在为低成本、便携式拉曼光谱仪的开发做出贡献，其中“低成本”指使用商用现成组件构建的仪器，价格低于台式光谱仪的十分之一，能够辅助皮肤癌诊断。该设备既可用于临床应用，也可用于那些投入时间和资源研究这些肿瘤但缺乏最先进设备所需大量资金的研究团队。为此，研究人员构建、校准并测试了一台LGL拉曼光谱仪，由商用光学组件组成，外壳采用增材制造技术制造，材料为聚乳酸（PLA）。使用对乙酰氨基酚样品进行校准，并通过将支持向量机（SVM）算法应用于从一名志愿者参与者收集的拉曼光谱中提取的特征来进行测试。进一步使用从八名未参与训练和测试阶段的参与者收集的光谱对机器学习模型进行初步验证，以研究其对良性和恶性病变进行分类的能力。本研究的主要目标是确定所开发的设备是否能够捕获不同皮肤病变的信息，以便在涉及初级保健诊所患者的更大规模研究中使用。

论文解读

一、研究背景与问题提出

皮肤癌是以皮肤细胞不受控制增殖为特征的疾病，主要分为黑色素瘤（melanoma）和非黑色素瘤两大类，后者以鳞状细胞癌和基底细胞癌最为常见。根据世界卫生组织（WHO）下属国际癌症研究机构的数据，非黑色素瘤皮肤癌在全球最常见确诊恶性肿瘤中排名第五。2022年，全球报告了约33.2万例新发黑色素瘤和123.4万例新发非黑色素瘤皮肤癌病例。目前最广泛使用的诊断方法是侵入性的皮肤活检，而早期准确诊断对降低发病率和死亡率至关重要。由于主要治疗方式涉及病变完全切除的手术，位于头颈部等美学重要区域的肿瘤需要尽可能少切除组织的同时保证足够切缘。诊断中的主要困难在于区分相似结构，例如将黑色素瘤与良性色素性病变（如脂溢性角化病）或癌前病变（如良性痣）区分开来。

多种非侵入性技术可用于辅助皮肤癌诊断，包括皮肤镜（dermoscopy）、反射共聚焦显微镜、光学相干断层扫描（OCT）、光声断层扫描和高频超声等。拉曼光谱（Raman spectroscopy）是其中一种基于光的非弹性散射（拉曼散射）的技术，可提供客观的分子指纹，无需样品制备，适合体内研究，且散射信号不受水干扰影响，非常适合分析生物样品中的生物分子信息。然而，商用拉曼光谱仪成本高昂，限制了其在资源有限环境中的推广。巴西国家卫生技术纳入委员会的报告显示，2023至2025年间统一卫生系统（SUS）中62.7%的技术纳入请求因高经济影响被拒绝。此外，初级保健环境中从识别可疑病变到组织病理学检查的平均间隔可达一个月至超过十二个月，近半数患者的活检诊断被行政和运营延误推迟。这些因素凸显了开发低成本、便携式、能够辅助皮肤癌诊断的技术的迫切需求。

二、研究内容与结论

本研究旨在开发一种低成本、便携式拉曼光谱仪，其中“低成本”指使用商用现成组件构建、价格低于台式光谱仪十分之一的仪器，能够辅助皮肤癌诊断。研究人员构建、校准并测试了一台LGL拉曼光谱仪，由商用光学组件组成，外壳采用增材制造技术以聚乳酸（PLA）材料打印。使用对乙酰氨基酚样品进行校准，并通过将支持向量机（SVM）算法应用于从志愿者参与者收集的拉曼光谱中提取的特征进行测试。进一步使用从八名未参与训练和测试阶段的参与者收集的光谱对机器学习模型进行初步验证，以研究其对良性和恶性病变进行分类的能力。研究的主要目标是确定所开发的设备是否能够捕获不同皮肤病变的信息，以便在涉及初级保健诊所患者的更大规模研究中使用。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要关键技术方法：第一，光学系统设计，使用Ansys Opticstudio?光线追迹软件优化检测系统（LGL光谱仪）中各光学组件之间的最佳距离，确定780 nm至1050 nm波长范围内各波长在探测器上的投影位置；第二，光谱分辨率评估，通过模拟狭缝光谱仪估算光学极限光谱分辨率（0.428 nm）和像素极限光谱分辨率（0.644 nm），并利用Huygens点扩散函数（PSF）截面验证瑞利判据；第三，三维建模与增材制造，使用Autodesk Inventor软件设计外壳，在BAMBU LAB X1 Carbon打印机上以PLA丝材打印，分为激发与收集系统和检测系统两个模块；第四，信号处理与机器学习分类，使用对乙酰氨基酚进行校准，采用非对称最小二乘（Asymmetric Least Squares）基线去除算法消除荧光信息，提取拉曼光谱特征后应用支持向量机（SVM）算法进行分类。数据采集方面，研究经巴西CEP/CONEP系统批准（CAAE注册号81209524.1.0000.0282），在巴西伯南布哥州Petrolina的门诊环境中进行，一名51岁男性志愿者提供了训练和测试数据，另八名参与者提供了初步验证数据。

四、研究结果

2.1 光学系统设计结果

选择780 nm激光作为激发源，因其比可见光谱激光引入更少的荧光，且近红外低能量波长可降低样品降解或烧伤风险。检测系统采用透镜-光栅-透镜（LGL）折射式配置，由狭缝（THORLABS S10HK）、准直透镜（THORLABS AC127-075-AB）、衍射光栅（THORLABS GTI25-03 A）、聚焦透镜（OLYMPUS PLN N4x）和CMOS相机（IDS U3-34E0XCP-M-NO）组成。光线追迹模拟确定每个波长在探测器上占据约1.82 mm垂直长度，所有波长在探测器上水平投影距离约3.62 mm。中继系统由准直透镜（THORLABS AC127-050-B）、长通滤光片（THORLABS FELH0800）和聚焦透镜（THORLABS AC127-075-AB）组成，用于滤除瑞利散射。

2.2 光谱分辨率极限结果

光学极限光谱分辨率为0.428 nm，像素极限光谱分辨率为0.644 nm。通过Huygens PSF截面模拟验证，780 nm和780.68 nm两个波长的质心间距超过艾里斑半径（4.705 nm），且对应约三个探测器像素，满足设计规范，因此该光谱仪可分辨间隔0.68 nm的两个波长。该值转换为拉曼位移单位为10.58 cm^-1，表明探测器对仪器分辨率的限制大于光学系统。

2.3 三维设计与组装结果

外壳设计准确容纳光学组件并防止杂散光进入。由于打印床尺寸限制，设备分为激发与收集系统和检测系统两个模块。激发与收集系统以50%填充率打印，检测系统以100%填充率打印，共消耗0.77 kg PLA丝材。

2.4 数据采集结果

所有皮肤信号均按照国际标准IEC 60825-1:1993的最大允许暴露量采集，使用0.3 W/cm²辐照度、780 nm恒定二极管激光束，光束直径3 mm，总激光功率20 mW，每个样品采集60秒。训练和测试数据来自一名51岁白人男性参与者，具有经皮肤科医生诊断的良性色素性脂溢性角化病（SK）病变和经组织病理学检查确诊的恶性色素性基底细胞癌（BCC）病变。共采集脂溢性角化病信号17个（前额）、基底细胞癌信号17个（面颊）、健康皮肤信号19个（前额和面颊）。初步验证数据来自八名参与者，包括三个临床可疑恶性病变和五个脂溢性角化病病变。

2.5 数据分析结果

2.5.1 激光不稳定性处理结果

所有测量在23°C恒温环境中进行，每次测量前激光开启60秒，皮肤信号采集60秒，之后激光关闭至少120秒。采集期间通过激光驱动器中的恒定分流电阻实时监测激光电流，未观察到电流变化。由于拉曼散射独立于入射波长，激光中心波长的微小变化表现为图像的水平位移，但瑞利散射和拉曼散射线之间的像素距离保持不变，因此校准过程利用该固定距离可减轻激发不稳定性。

2.5.2 信号处理结果

皮肤拉曼光谱的指纹区（800 cm^-1至1800 cm^-1）包含大量可用于分类的峰。信号处理步骤包括：识别狭缝高度并沿y轴对矩阵进行分箱（binning）；去除相机产生的背景噪声；确定瑞利信号与对乙酰氨基酚第一个可测量峰（328 cm^-1）之间的像素距离；从该峰基部截断信号并进行最小-最大归一化以去除瑞利散射信息；采用非对称最小二乘基线去除算法（平滑参数λ=1000）去除荧光信息；再次归一化信号。

五、讨论与结论

本研究证明了一种使用商用现成组件和增材制造技术构建的低成本拉曼光谱仪能够捕获不同皮肤病变的信息。该设备成本低于商用台式光谱仪的十分之一，具有便携性和易操作性，可将激光束直接对准皮肤病变部位。初步结果表明该设备能够区分脂溢性角化病、基底细胞癌和健康皮肤的拉曼光谱信号，支持向量机（SVM）分类模型在初步验证中展现出区分良性和恶性病变的能力。该设备既可用于临床应用，也可用于缺乏最先进设备所需大量资金的研究团队。研究的主要结论是所开发的设备能够捕获不同皮肤病变的信息，可用于涉及初级保健诊所患者的更大规模研究，为皮肤癌的早期非侵入性诊断提供了一种经济可行的技术支持方案。