《Scientia Horticulturae》：Molecular characterization of the WRKY gene family in ginkgo (
Ginkgo biloba L.) reveals
GbWRKY33 as a positive regulator of salt stress tolerance
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银杏（Ginkgo biloba L.）作为银杏目现存唯一的代表物种，是一类起源可追溯至侏罗纪时期（约1.7亿年前）的活化石植物，其跨越地质年代而保持高度稳定的形态特征彰显了非凡的环境适应能力。当前关于银杏盐胁迫响应的研究主要集中于生理层面，涵盖形态变化、次生
银杏（Ginkgo biloba L.）作为银杏目现存唯一的代表物种，是一类起源可追溯至侏罗纪时期（约1.7亿年前）的活化石植物，其跨越地质年代而保持高度稳定的形态特征彰显了非凡的环境适应能力。当前关于银杏盐胁迫响应的研究主要集中于生理层面，涵盖形态变化、次生代谢物谱、渗透调节及光合性能等方面。新兴组学手段已鉴定出大量盐响应基因及潜在调控转录因子（Transcription Factor, TF），转基因研究亦表明银杏BBX25与KWD1-like基因可在异源系统中增强耐盐性。然而，WRKY转录因子在银杏盐适应中的具体贡献尚待深入探究。本研究对银杏WRKY基因家族进行了系统分析，阐明其系统发育关系、基因结构与演化模式。通过转录组学分析，研究人员鉴定出多个盐响应GbWRKY基因，其中GbWRKY33表现出尤为强烈的诱导表达。遗传转化功能研究表明，GbWRKY33作为耐盐正调控因子发挥作用，并可能直接结合并激活GbFLS2（类黄酮生物合成）与GbSOS1（离子稳态）的启动子。上述发现阐明了WRKY介导银杏盐适应的分子基础，并为通过育种或生物技术手段增强木本多年生植物逆境抗性提供了潜在靶点。
一、研究背景与科学问题
土壤盐渍化是全球农业面临的最严峻环境限制因素之一，通过扰乱基本代谢过程对种子萌发、营养生长及作物产量造成不利影响。盐胁迫通过三种相互关联的机制发挥作用：渗透胁迫、离子毒害及次生胁迫效应。土壤溶液中高浓度的钠离子（Na?）与氯离子（Cl?）降低根表水势，形成生理干旱；同时，盐离子在细胞内的过量积累破坏离子稳态，尤其干扰钾离子（K?）吸收并损害胞质中多种酶促过程；这些初级胁迫继而触发氧化损伤与养分失衡等次生效应。
植物通过复杂的转录重编程响应盐胁迫，尤其是激活参与离子稳态与解毒的基因。SOS（Salt Overly Sensitive）通路是耐盐性关键信号级联，由质膜定位的Na?/H?反向转运蛋白（SOS1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（SOS2）及钙结合蛋白（SOS3）组成。类黄酮作为植物次生代谢物的重要类别，凭借其强效抗氧化能力促进胁迫适应，有效清除过量活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）。WRKY蛋白构成植物特有的庞大转录因子家族，以保守WRKY结构域及关联锌指基序为特征，可识别W-box顺式元件。该家族在系统发育上分为三组：Group I（含两个WRKY结构域）、Group II（含单一结构域，细分为IIa-IIe亚组）及Group III（含C2HC锌指）。
银杏作为银杏目唯一现存成员，其盐胁迫响应的分子机制研究仍十分有限。尽管转录组分析已鉴定出多个盐响应基因及潜在调控转录因子，异源转基因研究亦证实部分基因可增强耐盐性，但WRKY转录因子在银杏盐适应中的具体贡献仍属空白。因此，系统鉴定银杏WRKY基因家族、解析其演化特征并阐明关键成员在盐胁迫中的功能与调控机制，具有重要的科学意义与应用价值。
二、研究内容与主要结论
本研究对银杏WRKY转录因子家族进行了系统鉴定与全面分析，并深入解析了GbWRKY33在耐盐调控中的功能机制。主要发现包括：银杏基因组共编码48个非冗余GbWRKY转录因子，为所比较裸子植物中数量最少者；系统发育分析显示银杏缺乏Group IIa成员，Group II其余亚组（IIb-IIe）分别含6、24、4、4个成员，Group III含3个成员；染色体定位显示基因在10条染色体上呈不均等分布，1号染色体密度最高（42.11%）；共鉴定出7对由片段重复产生的重复基因对，未发现串联重复事件；启动子区富含激素响应、胁迫响应及生长发育相关顺式调控元件。表达分析表明，GbWRKY33在根部特异性高表达，并在低、中、高盐胁迫下分别上调2.32倍、3.53倍和5.10倍。WGCNA共表达网络分析鉴定出与类黄酮含量（r=0.96）及Na?/K?比值（r=?0.91）显著相关的turquoise模块，GbWRKY33、GbFLS2与GbSOS1均被鉴定为候选枢纽基因。亚细胞定位实验证实GbWRKY33定位于细胞核。烟草瞬时转化与拟南芥稳定转化实验表明，GbWRKY33过表达显著增强耐盐性，表现为抗氧化酶活性升高、脯氨酸积累增加、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量降低及根系Na?/K?比值维持较低水平。酵母单杂交与双荧光素酶报告系统证实GbWRKY33可直接结合并激活GbSOS1与GbFLS2启动子。
三、关键技术与方法
研究人员综合运用多种技术手段：基于隐马尔可夫模型（Hidden Markov Model, HMM）与同源比对策略鉴定WRKY家族成员；利用邻接法（Neighbor-Joining, NJ）构建系统发育树；通过MCScanX进行共线性与基因重复分析；对盐胁迫处理（0、100、200、300 mM NaCl）的银杏幼苗根部进行转录组测序（Illumina HiSeq-2500平台，数据已提交至中国国家生物信息中心数据库，登录号PRJCA051453）；运用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）构建共表达网络；通过农杆菌介导的烟草瞬时转化与拟南芥花序浸蘸法稳定转化进行功能验证；采用酵母单杂交与双荧光素酶报告系统验证蛋白-DNA相互作用。
四、研究结果
4.1 GbWRKY转录因子的理化特征鉴定
通过整合生物信息学策略，在银杏基因组中鉴定出48个非冗余GbWRKY转录因子。与其它裸子植物相比，银杏WRKY基因家族规模相对较小。蛋白质分子量范围为13,692.37至93,828.26 Da，氨基酸长度121至860个，等电点4.72至9.55，所有蛋白均预测定位于细胞核。
4.2 GbWRKY转录因子的系统发育关系分析
基于邻接法重建银杏与杨树WRKY蛋白的系统发育树，蛋白被划分为三个主要组群。Group I含7个成员，Group II中未鉴定到IIa亚组成员，IIb、IIc、IId、IIe亚组分别含6、24、4、4个成员，Group III含3个成员。核心WRKYGQK基序在所有组群中保守，但部分Group IIc蛋白存在变异。
4.3 染色体分布、基因重复与共线性分析
GbWRKY基因在10条染色体上呈不均等分布，1号染色体密度最高（42.11%），2号和10号染色体各仅含1个基因。共鉴定出7对片段重复基因对，未发现串联重复事件。银杏与毛果杨之间存在1对共线性基因对，与拟南芥未检测到共线性关系。
4.4 基因结构、保守基序与顺式元件分析
鉴定出10个保守基序（8-50个氨基酸），同一系统发育组内的蛋白通常共享相似的基序组成。GbWRKY基因内含子数量为1至10个不等，同一亚家族内基因常呈现保守的内含子-外显子结构。启动子区鉴定出激素响应、胁迫响应及生长发育相关三类顺式调控元件，其中光响应元件最为丰富。
4.5 GbWRKY33在盐胁迫下的基因表达谱
组织特异性表达分析显示，近半数GbWRKY基因在根部高表达。盐胁迫转录组分析表明，7个基因在所有处理下均不表达，4个基因下调，多数基因上调。GbWRKY33在根部特异性高表达，并在低、中、高盐胁迫下分别上调2.32倍、3.53倍和5.10倍，提示其参与根部发育并在盐胁迫响应中发挥特定作用。
4.6 GbWRKY33的WGCNA共表达网络分析
以类黄酮含量和Na?/K?比值为性状数据进行WGCNA，鉴定出11个模块。turquoise模块与类黄酮含量呈强正相关（r=0.96），与Na?/K?比值呈强负相关（r=?0.91）。GbWRKY33、GbFLS2和GbSOS1均具有高模块成员度（kME值分别为0.94、0.92和0.90），被鉴定为候选枢纽基因。
4.7 GbWRKY33的亚细胞定位
GbWRKY33全长cDNA长度为396 bp，编码132个氨基酸的蛋白。GbWRKY33-GFP融合蛋白在烟草表皮细胞中呈现特异性核荧光信号，而游离GFP对照呈全细胞信号，证实GbWRKY33为核定位转录因子。
4.8 GbWRKY33转化后的生理变化与基因表达模式评估
烟草瞬时转化实验显示，盐胁迫下过表达GbWRKY33的叶片MDA含量降低、类黄酮含量升高。拟南芥稳定转化株系在盐胁迫下表现出显著优于野生型的表型，包括更高的萌发率、更长的根系及更高的叶绿素含量。生理指标分析表明，转基因株系具有更高的SOD和POD活性、更高的类黄酮和脯氨酸含量、更低的MDA水平及更低的根系Na?/K?比值。
4.9 GbWRKY33激活盐胁迫响应基因的表达
转基因烟草中ROS清除基因（NbSOD、NbCAT、NbAPX）表达上调；转基因拟南芥中SOS通路基因（AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3）、抗氧化酶基因（AtSOD1、AtPOD1）及离子转运蛋白基因AtNHX1均被诱导表达。
4.10 酵母单杂交与双荧光素酶报告系统验证
酵母单杂交实验证实GbWRKY33可与GbSOS1和GbFLS2启动子直接物理结合。双荧光素酶报告实验显示，GbWRKY33共表达可显著提高两个靶标启动子的LUC/REN比值，证实其转录激活功能。
五、讨论与结论
讨论部分指出，银杏WRKY基因家族规模较小，与裸子植物中转录因子家族整体扩张有限一致，可能归因于早期分化种子植物中大规模全基因组重复事件的缺乏。Group IIa成员的缺失可能代表早期维管植物中的古老演化事件。Group IIc成员（包括盐诱导的GbWRKY33）的序列变异可能促进功能多样化。研究证实GbWRKY33通过双重机制增强耐盐性：一方面直接激活GbSOS1促进Na?外排以维持离子稳态；另一方面直接激活GbFLS2促进类黄酮生物合成以增强ROS清除能力。研究同时承认异源表达系统无法完全还原裸子植物中的调控网络，未来需在银杏中建立稳定遗传转化体系以进行原生验证。
研究结论：本研究在银杏中鉴定并分析了48个GbWRKY转录因子。基因结构、演化关系、共线性及启动子区分析表明GbWRKY转录因子在演化上保守但缺乏Group IIa成员。研究揭示GbWRKY33作为银杏中盐诱导的Group IIc转录因子，在调控盐胁迫响应中发挥潜在作用。亚细胞定位确认其核靶向性。烟草瞬时表达与拟南芥稳定转化均赋予显著增强的耐盐性，表现为抗氧化酶活性升高、脯氨酸积累增加及MDA水平降低。基因表达分析表明GbWRKY33过表达显著诱导转基因株系中一系列胁迫响应基因。机制上，GbWRKY33可直接结合GbFLS2和GbSOS1启动子并驱动其上调表达，从而促进类黄酮生物合成并优化Na?/K?稳态，共同增强盐逆境抗性。上述结果为解析WRKY转录因子在银杏盐环境适应中的调控网络奠定了关键分子基础。
