引言
胞内pH是调控活细胞内几乎所有基本生理活动的核心因素，广泛参与细胞凋亡、增殖与分化、跨膜离子转运、膜电位维持、细胞骨架组装及动态细胞信号级联等生物过程[1], [2], [3]。亚细胞器依赖不同的pH微环境来执行其独特的生化功能，真核细胞进化出了精密的离子泵[4], [5]、缓冲系统和转运蛋白，以在正常生理条件下将胞质pH严格稳定在约7.2[6]。与健康体细胞的弱碱性胞质形成鲜明对比，肿瘤细胞呈现出特征性的酸性胞内微环境，其pH值徘徊在6.5左右[7], [8]。这种代谢性酸中毒源于著名的Warburg效应：恶性细胞优先进行有氧糖酵解而非高效的线粒体氧化磷酸化以维持快速增殖，导致大量氢离子和乳酸代谢产物在胞内蓄积和滞留[9], [10], [11]。
肿瘤细胞内持续存在的酸性状态不仅是异常能量代谢的副产品，更是驱动恶性进展的关键因素。低胞内pH会重塑多种酶的空间构象和催化活性，加速肿瘤细胞增殖，并上调基质金属蛋白酶以降解细胞外基质屏障，从而促进局部侵袭和远处转移[14], [15], [16]。此外，酸性胞内区室还会阻碍化疗药物的摄取并加速药物外排，由此引发多药耐药，严重削弱临床抗肿瘤疗效[17]。鉴于胞内酸化与肿瘤的发生、进展及耐药之间密切相关，实时可视化监测胞内pH波动为在肿瘤发生早期识别癌前病变提供了一种可行策略。此类监测工具亟需提供关键技术支撑，以服务于早期癌症筛查、病理分级及抗肿瘤治疗的动态评估[18], [19], [20]。因此，开发能够特异性可视化肿瘤pH梯度的高性能成像探针已成为肿瘤生物分析和分子成像领域的重要研究前沿。
在众多生物成像模式中，荧光成像以其不可替代的优势脱颖而出，包括无创检测、超高分辨率的时空分辨率、优异的检测灵敏度以及实时动态追踪亚细胞微环境变化的能力[21], [22]。分子荧光探针作为荧光生物成像的核心功能试剂，能够轻松穿透细胞膜并精确锚定亚细胞区室，输出直观的光学读数以反映活细胞内即时的物理化学变化[23], [24], [25], [26], [27]。迄今为止，已有大量荧光探针被用于各种胞内生物标志物、金属离子和微环境参数的定量检测[28], [29]。特别是，与单强度探针相比，比率型荧光探针在pH传感领域获得了压倒性的青睐。单通道荧光读数极易受到探针负载不均匀、光漂白和仪器参数漂移等外部干扰，从而引入显著的定量误差。相比之下，比率型探针依赖两个独立发射带的强度比进行定量计算，有效自校正了探针浓度和检测设备带来的干扰，为复杂生物基质提供了更稳定、可重复且准确的定量结果[30], [31], [32], [33], [34], [35]。
此前文献报道了大量具有多样化荧光基团和靶向基团的比率型pH荧光探针。Yuan课题组构建了一种基于半花菁骨架的比率型近红外pH探针，可选择性蓄积在溶酶体中并在细胞应激条件下可视化溶酶体pH变化[36]。James及其同事开发了一种多功能苯并噁唑-亚甲基杂化探针，实现了在线粒体内对pH、亚硫酸氢盐和粘度的同步比率型检测[37]。然而，现有的大多数pH响应性荧光探针仅靶向特定的亚细胞器（如溶酶体、线粒体、脂滴等），缺乏对肿瘤细胞的固有识别能力。当应用于混合细胞共培养或完整动物组织时，这些探针会在正常细胞和肿瘤细胞中均产生广泛的非特异性荧光信号，严重限制了其精确识别肿瘤的能力。
将肿瘤特异性靶向肽共价偶联到荧光骨架上，已成为增强成像探针肿瘤选择性富集能力的成熟有效策略[38]。RGD（Arg-Gly-Asp）肽是迄今为止得到最广泛验证的肿瘤靶向配体之一[39], [40], [41]。作为存在于循环细胞外基质蛋白中的天然肽片段，RGD对多种恶性细胞系细胞膜上过表达的αvβ3整合素受体表现出高亲和力。αvβ3整合素是一种重要的跨膜蛋白，介导肿瘤血管生成、细胞迁移、局部侵袭和远处转移，而在静止的正常体细胞和成熟血管内皮细胞上几乎不表达[42], [43], [44]。得益于αvβ3整合素在肿瘤细胞和健康细胞之间显著的表达差异，RGD修饰的荧光探针可选择性结合并内化进入肿瘤细胞，大幅减少正常组织中的脱靶荧光信号，从而提高肿瘤成像的特异性。
基于上述研究背景，本研究选用具有典型激发态分子内质子转移（ESIPT）发光特性的4-氨基-2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯酚（ABAH）作为核心荧光骨架，设计并合成了一种用于胞内pH可视化的比率型荧光探针P-2，如图式1所示。ABAH荧光基团固有地具有多重优势，包括比率感知响应、大的Stokes位移和环境敏感性发光。此外，其分子结构同时含有游离的酚羟基和伯氨基；这两个活性位点可独立进行化学衍生化，为后续功能基团和靶向肽的逐步接枝提供了充足的修饰灵活性。在本研究中，通过马来酰亚胺功能化对ABAH骨架上的氨基进行修饰，使探针能够与硫醇基团进行高效生物正交点击化学反应；同时，吡啶碱基的引入扩展了分子的共轭体系，将荧光发射光谱红移并增强了组织穿透力，从而满足了体内荧光成像的要求。体外光谱测试结果表明，探针在pH 4.0-7.0的生理酸性范围内展现出优异的pH响应灵敏度和可逆循环性能，完全覆盖了肿瘤细胞内的酸性范围；细胞水平实验证实该探针具有良好的生物相容性和极低的细胞毒性，能够稳定地进行活细胞荧光成像并实时追踪由离子载体尼日利亚红霉素（nigericin）引起的胞质pH波动。在此基础上，将末端修饰有半胱氨酸（携带游离硫醇基团）的RGD肽通过点击化学偶联到探针P-2上，制备了靶向探针P-2-RGD；通过肿瘤细胞与正常细胞共培养模型的对比成像实验，直接验证了该探针在偶联RGD肽后具备特异性靶向肿瘤细胞的能力，有效解决了传统pH荧光探针非特异性成像的局限。本研究开发的具有靶向比率功能的ESIPT型pH响应性荧光探针为肿瘤酸性微环境的可视化提供了新的分子设计思路，同时也为肿瘤早期精准荧光成像试剂的开发提供了可靠的实验基础[45], [46]。
