胡杨PeIDD5通过调控PeNAC029抑制杨树耐盐性

《Plant Physiology and Biochemistry》：Populus euphratica PeIDD5 regulates PeNAC029 to suppress salt tolerance in poplars

　　

NAC家族转录因子（transcription factors，TFs）在植物对盐胁迫的响应中发挥多样且往往相反的作用。多个成员（包括VvNAC1、OsNAC022、OsNAC3和MbNAC22）已被证明可赋予增强的耐盐性，而其他成员（如OsNAC2、GmNAC2和RtNAC100）则作为负调控因子，增加对盐胁迫的敏感性。在胡杨（Populus euphratica）中，NAC转录因子PeNAC029通过抑制磷脂酶D（phospholipase D，PLD）–磷脂酸（phosphatidic acid，PA）信号级联反应，作为耐盐性的关键抑制因子发挥作用，该通路是木本和草本物种胁迫适应中保守的关键通路。PeNAC029在其N端区域（第102–136位残基）含有一个具有LVFY基序的NAC抑制结构域（NARD-like）。PeNAC029通过直接结合多个PLD基因的启动子，在转录水平上抑制其表达，从而在盐胁迫条件下降低PLD酶活性并限制PA的产生。这种减弱作用破坏了盐胁迫下依赖PLD–PA的Na+/H+反向转运体激活和抗氧化系统的强化。值得注意的是，在长期盐胁迫下，胡杨中PeNAC029的表达下调，这有助于其对盐碱生境的生态适应。尽管已有上述功能认知，但控制盐胁迫下PeNAC029抑制的上游转录模块仍未得到充分表征。 INDETERMINATE DOMAIN（IDD）家族构成植物特异性C2H2锌指转录因子亚群，以其保守的DNA结合IDD结构域为特征。这些调控因子对多种生理过程至关重要，包括器官发生、生殖发育和非生物胁迫适应。其在盐胁迫下的表达动态因物种和组织而异。在功能上，IDD通过精细调控参与胁迫感知、信号转导和胁迫缓解的下游基因转录来介导耐盐性。基于这些发现，本研究从胡杨中鉴定了一个IDD家族转录因子PeIDD5，作为直接结合PeNAC029启动子的上游调控因子。鉴于AtIDD4直接靶向NAC家族转录因子（如NAC072、NAC019和NAC083），研究人员假设PeIDD5同样调控PeNAC029的表达。本研究提供了证实该调控关系的实验证据，并阐明其在胡杨盐适应调控中的功能意义。 本研究探究了转录模块PeIDD5–NAC029在两种对比杨树——胡杨（耐盐）和银白杨×欧洲山杨杂种（P. × canescens，盐敏感）——耐盐性中的功能。通过体外和体内实验方法，研究人员确证PeIDD5直接结合PeNAC029和PcNAC029启动子区域中存在的保守顺式元件TTTGTCC，从而作为转录激活因子发挥作用。在P. × canescens中，PeIDD5过表达导致PcNAC029升高，而在胡杨叶片中通过病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）沉默PeIDD5则导致PeNAC029转录水平降低。重要的是，在P. × canescens中过表达PeIDD5或PeNAC029降低了PLD活性和PA浓度，导致Na+和活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累增加，从而在盐胁迫条件下损害生长和光合性能。相反，在胡杨叶片中沉默PeIDD5–PeNAC029模块则增强了PLD活性和PA积累，促进盐胁迫下Na+和ROS稳态的维持。因此，PeIDD5在转录水平上激活PeNAC029和PcNAC029，抑制PLD酶活性并减少PA积累，扰乱盐胁迫杨树中的离子和氧化还原稳态。在长期盐胁迫下，胡杨下调PeIDD5表达以抑制PeNAC029转录，从而限制PeNAC029对PLD–PA信号的不利影响，促进胡杨对盐碱环境的适应。据此，旨在抑制PeIDD5–NAC029调控模块的遗传策略可应用于培育耐盐性改良的杨树品种。

论文解读

一、研究背景与科学问题

NAC家族转录因子在植物盐胁迫响应中扮演着复杂且往往相互对立的角色。部分成员如VvNAC1、OsNAC022、OsNAC3和MbNAC22被证实可增强植物耐盐性，而另一些成员如OsNAC2、GmNAC2和RtNAC100则作为负调控因子增加植物对盐胁迫的敏感性。在胡杨中，NAC转录因子PeNAC029已被鉴定为耐盐性的关键抑制因子，其通过抑制磷脂酶D–磷脂酸信号级联反应发挥作用。PeNAC029含有一个NAC抑制结构域（NARD-like），该结构域在其N端区域（第102–136位残基）具有LVFY基序。PeNAC029通过直接结合多个PLD基因启动子，在转录水平上抑制其表达，从而降低盐胁迫下PLD酶活性并限制PA产生。这种抑制破坏了盐胁迫下依赖PLD–PA的Na⁺/H⁺反向转运体激活和抗氧化系统的强化。值得注意的是，胡杨在长期盐胁迫下会下调PeNAC029表达，这被认为是其对盐碱生境生态适应的关键机制之一。然而，控制盐胁迫下PeNAC029抑制的上游转录模块此前尚未得到阐明，这构成了本研究开展的核心科学问题。

INDETERMINATE DOMAIN（IDD）家族是植物特异性C₂H₂锌指转录因子亚群，以保守的DNA结合IDD结构域为特征。IDD调控因子参与多种生理过程，包括器官发生、生殖发育和非生物胁迫适应。已有研究表明，在拟南芥中AtIDD4可直接靶向NAC家族转录因子如NAC072、NAC019和NAC083。基于此，研究人员提出假设：胡杨中是否存在类似的IDD转录因子直接调控PeNAC029的表达？本研究正是围绕这一科学假设展开，旨在鉴定PeNAC029的上游调控因子并阐明其在胡杨盐适应中的功能意义。

二、研究内容与主要技术方法

本研究系统探究了转录模块PeIDD5–NAC029在两种对比杨树——耐盐的胡杨和盐敏感的银白杨×欧洲山杨杂种——耐盐性中的功能。研究人员首先通过生物信息学预测从胡杨中鉴定出IDD家族转录因子PeIDD5，随后通过一系列分子生物学和遗传学实验验证其功能。

研究采用的主要关键技术方法包括：酵母单杂交（yeast one-hybrid，Y1H）实验验证蛋白–DNA直接结合；双荧光素酶报告基因（dual-luciferase reporter，DLR）实验在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中验证转录激活活性；凝胶迁移率变动实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）验证PeIDD5对靶标顺式元件TTTGTCC的序列特异性结合；亚细胞定位实验确认PeIDD5的核定位；农杆菌介导的稳定遗传转化获得P. × canescens过表达株系；病毒诱导基因沉默（VIGS）技术实现胡杨叶片中PeIDD5和PeNAC029的功能敲低；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blotting检测基因表达和蛋白积累；非损伤微测技术（non-invasive micro-test system，NMT）实时监测Na⁺离子流动态；电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定组织Na⁺浓度；酶活性测定和ELISA分别检测PLD活性和PA含量；叶绿素荧光参数测定评估光合性能。

三、主要研究结果

3.1 PeIDD5的生物信息学特征分析

研究人员从胡杨基因组DNA中分离了PeNAC029上游启动子片段，通过PlantRegMap数据库进行生物信息学预测和筛选，鉴定出IDD家族转录因子PeIDD5作为PeNAC029的推定转录激活因子。PeIDD5编码一个含547个氨基酸（59.33 kDa）的C₂H₂型锌指转录因子，等电点（pI）为9.47。结构域分析鉴定出两个参与序列特异性DNA结合的经典C₂H₂锌指基序，以及两个参与蛋白–蛋白相互作用的C₂H₂锌指结构域。多序列比对显示PeIDD5与毛果杨（P. trichocarpa）的PtrIDD5直系同源蛋白高度保守，系统发育分析表明PeIDD5、PtrIDD5和黑杨（Populus nigra）的PnIDD5紧密聚在同一进化支。

3.2 PeIDD5的亚细胞定位

通过35S::PeIDD5-GFP融合构建体在本氏烟草表皮细胞中进行瞬时转化，共聚焦显微镜观察显示PeIDD5-GFP荧光仅在细胞核中检测到，与DAPI核染色信号共定位，而35S::GFP对照在整个细胞质和细胞核中呈现均匀荧光，确认PeIDD5是核定位蛋白。

3.3 盐胁迫下PeIDD5和PeNAC029的转录谱**

对胡杨幼苗进行150 mM NaCl处理15天，RT-qPCR分析显示PeIDD5转录本丰度在根中6小时达到峰值，茎和叶中12小时达到峰值，随后迅速下降，至处理第15天已低于对照水平。PeNAC029呈现与PeIDD5相似的表达模式，NaCl诱导的转录本在12–24小时达到峰值后下降，15天处理结束时低于对照水平。

3.4 PeIDD5与PeNAC029和PcNAC029启动子的相互作用**

序列分析发现PeNAC029-pro和PcNAC029-pro均含有保守的TTTGTCC顺式作用元件。酵母单杂交实验中，pB42AD-PeIDD5与pLacZi-PeNAC029-pro或pLacZi-PcNAC029-pro共转化均产生强烈的蓝色显色反应，表明存在蛋白–DNA相互作用，而所有阴性对照均无显色信号。双荧光素酶报告基因实验中，效应子与两种报告基因组合均产生比对照更强的发光信号，证明PeIDD5能激活两个启动子的转录。EMSA实验证实PeIDD5特异性结合含有天然TTTGTCC基序的生物素标记探针，该结合可被10倍摩尔过量未标记探针竞争性抑制，而核心基序突变为TTTATAA的突变探针则不产生迁移位移，证明PeIDD5的识别依赖于完整的TTTGTCC顺式元件。

3.5 PeIDD5和PeNAC029转基因杨树的耐盐性

研究人员在盐敏感杨树P. × canescens中分别过表达PeIDD5和PeNAC029，获得多个独立转基因株系。经150 mM NaCl处理15天后，PeIDD5-OE株系（OE3、OE4、OE6）表现出比野生型（WT）显著更强的盐敏感性，株高和茎径分别下降26%和27%，而WT仅下降16%和19%。PeNAC029-OE株系（OE5、OE8、OE9）同样表现出显著更强的生长抑制，株高和茎径分别下降26%和28%。光合性能方面，PeIDD5-OE株系叶绿素含量下降30%，ETR、YII和F_v/F_m下降39–54%，均显著大于WT的14%和19–24%；PeNAC029-OE株系叶绿素含量下降27%，光合参数下降45–59%，均显著大于WT的7–29%。在胡杨叶片中进行的瞬时过表达和VIGS沉默实验验证了转基因表达和沉默效率，为后续生理分析提供了分子水平确认。

3.6 盐胁迫下PeIDD5和PeNAC029转基因杨树的抗氧化防御

DAB组织化学染色显示，胡杨叶片经150 mM NaCl处理48小时后，PeIDD5-OE和PeNAC029-OE叶片积累显著更多的H₂O₂，而PeIDD5-VIGS和PeNAC029-VIGS叶片染色明显减弱。相对电解质渗漏（REL）结果与之一致：过表达叶片REL显著升高，沉默叶片REL显著低于WT。过表达叶片中SOD、CAT和POD活性显著降低，PePODA2、PeSOD[Cu-Zn]和PeCAT1转录水平显著下调；沉默叶片中上述酶活性和基因表达则显著上调。在P. × canescens稳定转基因株系中，盐胁迫下WT的POD、SOD和CAT活性分别增加39%、32%和101%，而PeIDD5-OE株系仅增加29%、26%和56%，PeNAC029-OE株系仅增加17%、4%和36%。抗氧化基因表达模式与酶活性变化一致。

3.7 盐胁迫下PeIDD5和PeNAC029转基因杨树的Na⁺积累

PeIDD5-OE和PeNAC029-OE胡杨叶片积累显著更多的Na⁺，NMT实时离子流监测显示其净Na⁺外排显著低于WT和沉默叶片，表明胞质Na⁺主动外排受损。这种缺陷伴随核心SOS通路组分PeSOS1的转录抑制。相反，PeIDD5-VIGS和PeNAC029-VIGS叶片Na⁺积累减少，Na⁺外排增强。在P. × canescens稳定转基因株系中，PeIDD5-OE和PeNAC029-OE株系在根、茎、叶中均积累显著更高的Na⁺浓度，根尖净Na⁺外排较WT下降38–53%，伴随PcSOS1转录水平降低。

3.8 PeIDD5调控NAC029抑制转基因杨树中PLD活性和PA积累

在胡杨叶片中，PeIDD5-OE叶片PeNAC029转录水平显著高于WT，而PeIDD5-VIGS叶片则显著降低，证实PeIDD5是PeNAC029的正向上游调控因子。PeIDD5-OE和PeNAC029-OE叶片在盐胁迫下PLD活性和PA含量显著低于WT，而PeIDD5-VIGS和PeNAC029-VIGS叶片两者均显著升高。在P. × canescens稳定转基因株系中，PeIDD5-OE株系盐胁迫下PcNAC029表达较WT显著增加90%，PLD活性和PA含量显著低于WT；PeNAC029-OE株系同样表现出显著降低的PLD活性和PA积累。

四、讨论与结论

讨论部分指出，PeIDD5过表达的P. × canescens在盐胁迫15天后表现出显著降低的生长和受损的光合性能，确认PeIDD5负调控杨树耐盐性，与AtIDD4在拟南芥中赋予的盐敏感性增强一致。研究鉴定PeNAC029和PcNAC029为PeIDD5的直接下游效应因子，Y1H、EMSA、DLR和转录激活实验证明PeIDD5结合NAC029启动子并激活其转录。PeNAC029和PcNAC029含有功能性的N端抑制结构域（NARD-like），具有保守的LVFY基序。此前研究已证明PeNAC029直接结合PLD基因启动子中的顺式元件并抑制PLDα3、PLDβ2和PLDδ的转录。本研究表明，在PeIDD5过表达的胡杨和P. × canescens中，PeIDD5激活PeNAC029和PcNAC029表达，进而抑制盐胁迫下的PLD–PA信号；而PeIDD5沉默则降低PeNAC029转录，增强盐胁迫胡杨叶片中的PLD–PA信号。因此，长期盐胁迫诱导的PeIDD5下调降低了胡杨幼苗中PeNAC029丰度，从而促进这种耐盐杨树的盐适应。

研究结论可概括为：PeIDD5通过直接结合NAC029启动子中的TTTGTCC顺式元件，在转录水平上激活PeNAC029和PcNAC029表达，进而抑制PLD酶活性并减少PA积累，扰乱盐胁迫杨树的离子（Na⁺）和氧化还原（ROS）稳态，最终削弱耐盐性。在长期盐胁迫下，胡杨通过下调PeIDD5表达来抑制PeNAC029转录，限制PeNAC029对PLD–PA信号的不利影响，从而实现对盐碱环境的适应。据此，抑制PeIDD5–NAC029调控模块的遗传策略可用于培育耐盐性改良的杨树品种，具有重要的林木育种应用价值。