植物 miRNA–ROS 互作组：协调环境胁迫下氧化还原稳态与适应性的双向调控网络

《Plant Physiology and Biochemistry》：The miRNA–ROS Interactome: Orchestrating Plant Resilience to Environmental Fluxes

　　

活性氧（ROS）稳态与 microRNA（miRNA）介导的基因调控之间的相互影响已成为植物胁迫生物学的一个核心议题。研究人员整合了当前对 miRNA 与 ROS 之间双向调控的认识，并提出了"miRNA–ROS 互作组"这一框架，将其定义为一种整合性调控网络。在该网络中，miRNA 通过调节质外体、叶绿体和线粒体中 ROS 的产生与清除来控制 ROS 稳态，而 ROS 则反过来通过转录因子、表观遗传重塑和 miRNA 加工蛋白的氧化修饰来重塑 miRNA 的生物合成、加工和活性。研究人员进一步将特征明确的 miRNA–靶标模块组织成一个核心的氧化还原调控骨架，其中六个进化上保守的模块——miR398–CSD/CCS、miR408–PCY/LAC、miR528–AO/PPO、miR319–TCP/MYB、miR169–NF-YA 和 miR164–NAC——可被多种非生物胁迫差异性地招募以调控 ROS 产生与清除。在胁迫特异性层面，研究人员说明了 miRNA 模块如何将 ROS 调控与植物激素、钙和营养信号通路整合在一起，从而在干旱、盐碱、极端温度和重金属毒性条件下实现精细化的氧化还原控制。此外，研究人员还探讨了 miRNA–ROS 相互作用的时间动态，强调不同 miRNA 表现出瞬时、持续、延迟和反转的响应模式，并讨论了持续的 miRNA 调控状态（如 miR824–AGL16 和 miR156–SPL 模块）如何通过转录后机制促进胁迫记忆。最后，研究人员提出了塑造 miRNA–ROS 互作组未来研究的关键知识空白和新兴方法论前沿，并强调了其在设计耐胁迫作物中的转化潜力。

**引言**

植物作为固着生物，持续暴露于干旱、盐碱、极端温度、重金属毒害等非生物胁迫以及病原体和食草动物等生物胁迫之下。这些胁迫的一个共同后果是破坏细胞内 ROS 稳态——即 ROS 生成与其被抗氧化系统高效清除之间的动态平衡。主要 ROS 包括超氧阴离子（O₂^•?）和过氧化氢（H₂O₂），主要来源于叶绿体、线粒体和过氧化物酶体。ROS 具有双重性：在受控的生理水平下，它们充当传递胁迫信号和激活适应性通路的关键信号分子；然而，ROS 过度积累则会引发氧化胁迫，对脂质、蛋白质和 DNA 造成广泛损伤。因此，精确的时空 ROS 管理对植物的适应力至关重要。为避免术语歧义，本综述对三个核心术语给出了明确定义：ROS 稳态指 ROS 生成与清除之间的动态平衡，使 ROS 维持在生理适宜范围内；ROS 信号指受时空调控的 ROS 水平变化，传递信息至下游信号网络并调节胁迫适应性响应；氧化还原调控（redox regulation）是一个涵盖 ROS 依赖性氧化修饰与 ROS 非依赖性细胞氧化还原缓冲系统的更广泛概念。与氧化还原系统并行的是，microRNA（miRNA）作为基因表达的主调控因子发挥作用。这些约 20–24 核苷酸的非编码 RNA 由初级转录本经 DCL1–SE–HYL1 复合体加工而成，随后引导 RNA 诱导沉默复合体（RISC）对靶标 mRNA 进行切割或翻译抑制。miRNA 整合了发育程序和扰动氧化还原平衡的胁迫响应。过去十年中的一个重大概念性进展是认识到 miRNA 通路与细胞氧化还原过程之间存在广泛的双向调控。一方面，miRNA 通过靶向 ROS 产生相关基因（如 RBOH 基因）和 ROS 清除相关基因（包括酶促和非酶促抗氧化剂）来调节氧化还原景观；另一方面，ROS 直接在多个层面调控 miRNA 的生物合成——激活与 miRNA 基因启动子结合的氧化还原敏感性转录因子、诱导改变 miRNA 位点染色质可及性的表观遗传修饰、以及直接氧化核心 miRNA 加工蛋白（如 DCL）。尽管取得了这些进展，但大多数研究仅孤立地考察了 miRNA 到 ROS 或 ROS 到 miRNA 的单一方向。因此，一个整合其双向相互作用、特别是关注时空特异性、细胞器间通讯和核心模块进化保守性的连贯框架仍未建立。在本综述中，研究人员提出"miRNA–ROS 互作组"（miRNA–ROS interactome）作为一个基于证据的系统级框架，整合了两层相互调控关系：miRNA 介导的对 ROS 产生、清除及相关氧化还原过程的调控，以及 ROS 介导的对 miRNA 转录、生物合成、加工、积累和活性的调控。研究人员采用网络导向的视角，将 miRNA 到 ROS 和 ROS 到 miRNA 的双方向整合到统一调控框架中，并通过比较部分保守的核心模块与胁迫特异性和环境特异性模块，来探讨调控稳健性和功能可塑性如何产生。

**miRNA 介导的 ROS 产生调控**

植物通过质膜/质外体、线粒体和叶绿体中高度调控的、区室特异性的机制来协调 ROS 的产生。miRNA 主要通过靶向关键调控基因或调节这些区室内上游信号和转录网络来精细调控 ROS 的时空动态。

**质膜和质外体中 miRNA 介导的 ROS 产生**：质膜和质外体是胁迫下快速生成 ROS 信号的关键位点，主要通过产生质外体 O₂^•? 的 NADPH 氧化酶（RBOH）来实现。miRNA 通过三种不同的调控策略来调节 RBOH 介导的 ROS 产生。第一，通过生长素信号级联调控 RBOH 表达：水稻免疫过程中，OsmiR393a/b 的减少解除对 OsTIR1/AFB2 的抑制，加速 OsIAA10 降解并激活 OsARF12，后者反式激活 OsRBOHB，引发精确校准的 H₂O₂ 爆发以防御昆虫。第二，通过营养状态整合：拟南芥 miR399 在免疫启动条件下积累并抑制磷酸盐稳态负调控因子 PHO2，从而升高基础 RBOHD 表达水平。第三，通过转录因子网络：玉米中 zma-miR169 表达降低增加 NF-YA 转录因子水平，进而促进 ZmRBOHA 和 ZmRBOHB 转录。此外，miRNA 还可通过跨区室效应影响质外体 ROS：杨树 Pto-miR6427 靶向叶绿体硫氧还蛋白编码基因 CDSP32，其上调损害叶绿体抗氧化系统并反常地破坏质膜 RBOHD–MPK3 模块的激活，导致 ROS 失衡。

**miRNA 介导的叶绿体 ROS 产生**：叶绿体是光依赖性 ROS 生成的主要场所，光合电子传递链（PETC）的氧化还原状态决定电子向分子氧的传递。在光系统 I（PSI），过度还原导致 O₂^•? 形成；在光系统 II（PSII），过剩能量有利于单线态氧（¹O₂）产生。其中最具说服力的证据来自金属稳态通路：拟南芥在铜缺乏时，miR408 上调并抑制编码非必需铜蛋白（如植物花青素和漆酶）的转录本。这种铜节省策略将有限铜离子优先分配给必需叶绿体蛋白，包括维持 PETC 功能的质体蓝素和清除 O₂^•? 的叶绿体 Cu/Zn-超氧化物歧化酶（CSD2）。miR408 因此充当将营养信号与叶绿体氧化还原动态耦合的代谢整合子。

**miRNA 精细调控线粒体 ROS 产生**：线粒体 ROS 主要通过电子传递链（ETC）复合体 I 和 III 处的电子泄漏产生。在拟南芥中，镉胁迫抑制成熟 miR400 积累，解除对其线粒体定位靶标 PPR1 的抑制。PPR1 通过促进线粒体基因 ccmB 的 C-to-U RNA 编辑（细胞色素 c 生物合成所需）和增强复合体 III 活性来降低线粒体 ROS 水平。另一个保守 miRNA——miR398——也通过 COX5b-1 靶向线粒体呼吸链。这些例子确立了一种范式：miRNA 通过转录后调控呼吸链组分来调节线粒体 ROS。

**miRNA 介导的抗氧化防御系统调控**

ROS 的生理结果取决于其产生与清除之间的动态平衡。抗氧化系统包括酶促清除剂和非酶促氧化还原缓冲剂，miRNA 对该网络施加精确的多层次控制。

**协调酶促 ROS 清除级联反应**：酶促 ROS 清除级联从 SOD 介导的 O₂^•? 歧化开始，到 CAT/APX/GPX 介导的 H₂O₂ 脱毒。SOD 构成抗氧化防御的第一道防线，根据金属辅因子和亚细胞定位分为三类：Cu/Zn-SOD（CSD，细胞质和叶绿体定位）、Fe-SOD（FSD，叶绿体定位）和 Mn-SOD（MSD，线粒体定位）。miRNA 对 SOD 亚型施加异构体特异性调控，其中 miR398–CSD 轴是研究最透彻的 SOD 调控模块。在 H₂O₂ 清除酶方面，CAT 异构体主要定位于过氧化物酶体并表现出功能特化。miRNA 对 CAT 基因的直接调控证据有限，但间接地，保守的 miR164–NAC 模块通过抑制激活 CAT、SOD 和 POD 基因的 NAC 转录因子来调节 CAT 表达。APX 异构体定位于细胞质、叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和质外体，利用抗坏血酸（AsA）还原 H₂O₂。此外，GPX 和硫氧还蛋白（Trx）系统构成平行的巯基依赖性脱毒通路。

**miRNA 对还原力和底物再生的调控**：酶促 ROS 清除效率从根本上受还原当量可用性和抗氧化底物再生能力的制约。AsA–GSH 循环构成 H₂O₂ 脱毒的中心枢纽，需要单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）的协同作用。miRNA 通过直接靶向转录本和间接转录调控来调节这一再生机制。维持抗氧化循环所需的还原力主要来自 NADPH 生成途径，miRNA 通过靶向关键 NADPH 产生酶来战略性调节这一能量基础。

**miRNA 对非酶促抗氧化系统的调控**：植物还利用 AsA、GSH、类黄酮和类胡萝卜素等非酶促抗氧化剂来缓冲氧化胁迫。miRNA 通过调节底物库大小、再生速率和区室氧化还原状态来协调这一非酶促防御。miR528–AO 模块调控水稻质外体抗坏血酸氧化；硫缺乏诱导的 miR395 通过靶向低亲和力硫酸盐转运蛋白 SULTR2;1 和三个 ATP 硫酸化酶异构体（ATPS1、ATPS3、ATPS4）重新编程硫代谢，最终调节 GSH 合成。miR858a 通过翻译抑制 MYBL2 促进花青素积累；miR828 建立了一个多层转录后调控模块，通过触发 TAS4 转录本切割产生反式作用 siRNA（ta-siRNA）来精细调控花青素生物合成。

**ROS 作为植物 miRNA 调控网络的关键调节因子**

**ROS 物种特异性调控 MIR 基因转录及直接感知机制**：不同 ROS 物种根据其化学性质和亚细胞来源对 MIR 基因转录、miRNA 生物合成和效应活性施加不同的调控效应。H₂O₂ 可直接氧化转录因子中的特定氨基酸残基，从而调节 MIR 基因转录——水稻 OsbHLH25–MIR397b 通路提供了最完整的机制实例：病原菌诱导的 H₂O₂ 氧化 OsbHLH25 的 Met256，增强其与 MIR397b 启动子中 G-box 样元件的结合，抑制 MIR397b 转录。O₂^•? 主导的氧化条件影响 miRNA 表达和效应活性；最新证据表明 O₂^•? 主导条件可能损害 AGO1 稳定性。在高光条件下，光系统 II 产生的 ¹O₂ 促进 β-胡萝卜素氧化和 β-环柠檬醛（β-CC）的产生，β-CC 通过 MBS1 参与信号传递至细胞核，影响 pri-miRNA 和成熟 miRNA 的积累。

**ROS 与 Ca²⁺ 和植物激素信号在 miRNA 调控中的整合**：ROS 与 Ca²⁺ 和植物激素信号相互作用，在转录和转录后水平调控植物 miRNA。拟南芥质膜受体激酶 HPCA1 通过胞外半胱氨酸残基的氧化感知质外体 H₂O₂，导致 HPCA1 自磷酸化和 Ca²⁺ 内流的激活。在水稻中，Ca²⁺/CaM 信号正调控 miR156a、miR1878 和 miR396c-3p，但负调控 miR1876 和 miR167h-5p；OsCAMTA4 和 OsCAMTA6 与 MIR156A 启动子相互作用。ABA 信号方面，拟南芥 SnRK2.2/2.3/2.6 在 ABA 处理下促进 miRNA 生物合成，SnRK2 还与 miRNA 加工因子 SE 和 HYL1 结合，且 SnRK2.4/2.6 可在体外磷酸化这两种蛋白。BR 信号方面，H₂O₂ 主要在 Cys63 处氧化 BZR1 并增强其转录活性，从而将氧化还原状态与 BR 信号联系起来；BR 信号还调控 miR394–LCR 模块。

**ROS 通过转录因子调控 MIR 基因转录**：ROS 通过氧化还原敏感性转录因子调控 miRNA 转录。除上述 H₂O₂–OsbHLH25–MIR397b 模块的直接氧化还原调控外，ROS 相关信号还可通过 HSF、WRKY 等转录因子网络调控 MIR 转录。热胁迫期间 ROS 积累与 HSF 信号的激活密切相关，HSF 可直接结合 MIR169 启动子并促进其转录。ROS 相关信号还激活 MAPK 级联反应，导致 WRKY 转录因子磷酸化和激活——镉胁迫下 OsWRKY51 通过结合 MIR528 启动子抑制其表达。此外，来自细胞器的逆行信号也将 ROS 与转录因子介导的 miRNA 调控联系起来。

**ROS 对 miRNA 表达的表观遗传调控**：ROS 通过 DNA 甲基化和组蛋白修饰等表观遗传机制调节 miRNA 表达。在 Populus simonii 中，热和冷胁迫升高 H₂O₂ 水平并诱导全基因组甲基化变化，包括 Ptc-MIR156i/j 和 Ptc-MIR396e/g 位点的变化。ROS 还通过调控组蛋白修饰酶影响 MIR 转录。GCN5 是一个关键的组蛋白乙酰转移酶，通过 H3K14 乙酰化激活 MIR395 和 MIR399 等胁迫响应 miRNA 基因，同时也抑制 DCL1、SE、HYL1、AGO1 等核心 miRNA 生物合成基因，从而约束全局 miRNA 加工。额外的组蛋白修饰系统，包括 PRC2 介导的 H3K27 三甲基化，参与抑制 MIR156A/C 和其他 miRNA 基因。

**ROS 通过氧化还原翻译后修饰直接调节 miRNA 加工**：ROS 通过可逆的氧化翻译后修饰直接调节 miRNA 加工蛋白。miRNA 生物合成中的关键酶（包括 DCL 蛋白和双链 RNA 结合蛋白 HYL1、RTL1）含有保守的氧化还原敏感性半胱氨酸残基，氧化后可发生抑制性翻译后修饰，如 S-谷胱甘肽化或二硫键形成。这一直接氧化还原调控在一个自调控反馈环内运作：miR162 和 miR168 分别靶向 DCL1 和 ARGONAUTE1（AGO1）mRNA，精细调节加工能力以匹配细胞氧化还原需求。水稻中 OsDCL1a 过表达破坏抗氧化基因表达、升高 O₂^•? 水平并增强氧化胁迫敏感性，验证了该反馈环的生理意义。

**miRNA–ROS 相互作用的时间动态与胁迫记忆**

ROS 信号本质上是动态的，其生物学效应不仅取决于 ROS 丰度，还取决于 ROS 积累的时间、持续时间和恢复动力学。miRNA 对 ROS 的响应表现出强烈的时间依赖性，不同 miRNA 在诱导、持续和恢复模式上存在差异。在小麦 H₂O₂ 处理中，70 个响应 miRNA 表现出多样的时间表达模式，可归纳为瞬时响应、持续响应、延迟响应和反转响应。扩展的时间进程分析进一步表明，早期采样点（3–6 h）观察到的 miRNA 响应模式无法完全预测后期（9–24 h）的表达变化，提示胁迫进程中 miRNA 调控持续重塑。

**持久 miRNA 调控与胁迫记忆**：部分 miRNA 相关调控状态在胁迫解除后持续存在并有助于长期适应。在拟南芥中，miR824–AGL16 模块代表主要依赖成熟 miRNA 分子稳定性的转录后持久机制。重复轻度热胁迫下，MIR824 位点的转录激活是瞬时的，而成熟 miR824 逐步积累并在恢复期保持升高，导致其靶基因 AGL16 持续抑制直至胁迫终止后。miR824 因此被提出为一种转录后记忆因子，代表基于 RNA 水平持久性而非染色质转录记忆的独特胁迫记忆形式。miR156–SPL 模块提供了持久 miRNA 介导调控与功能性热胁迫记忆直接关联的补充范例：热胁迫后多个 miR156 家族成员表现出延长积累，miR156 主要有助于热胁迫记忆的维持而非初始耐热性建立。

**非生物胁迫氧化还原调控中的保守和胁迫依赖性 miRNA 模块**

比较研究表明，miRNA–ROS 调控模块可分为两大类：调控 ROS 产生与清除基本过程的保守核心模块，以及在特定环境条件下参与环境依赖性响应的胁迫特异性模块。六个进化上保守的核心模块构成了非生物胁迫氧化还原调控的骨架。miR398–CSD/CCS 模块是氧化还原调控中胁迫依赖性调控极性的典范：在大多数非生物胁迫（重金属、干旱）下 miR398 下调以增强 SOD 活性和氧化胁迫耐受，而热胁迫下 miR398 被 HSFA1b 和 HSFA7b 诱导以允许适度 ROS 积累来激活热激信号和耐热性。miR408–PCY/LAC 模块作为铜依赖性整合子，将营养状态与叶绿体 ROS 平衡耦合，在盐碱、冷和氧化胁迫下上调增强耐受，但在干旱下被 MYB44 抑制以促进 PCY 积累和 ABA 依赖性气孔关闭。miR528–AO/PPO 模块是单子叶植物特异性的氧化还原调控模块，以胁迫类型依赖性方式精细调控 ROS 稳态。miR319–TCP/MYB 模块通过 TCP 和 GAMYB 转录因子调节温度胁迫响应中的 ROS 稳态。miR169–NF-YA 模块靶向 NF-YA 转录因子并调节过氧化物酶活性和谷胱甘肽相关抗氧化通路，其下游效应通常汇聚于 PRX/GST 介导的 ROS 脱毒。miR164–NAC 模块在胁迫相关氧化还原失衡期间通过靶向 NAC 转录因子来调控抗氧化响应，提供了一条跨胁迫的转录途径以加强抗氧化程序并稳定氧化还原稳态。胁迫特异性模块则将氧化还原控制与激素信号、Ca²⁺ 动态、营养状态和结构性防御整合起来，共同为不同非生物胁迫所施加的独特生理需求定制氧化还原响应。

**生物相互作用与跨胁迫整合中的 miRNA 介导氧化还原调控**

植物持续面临真菌、细菌、病毒和昆虫的威胁。miRNA 通过转录后调控抗氧化和信号组分来调节 ROS 稳态，平衡免疫与氧化保护。真菌和卵菌病原菌诱导特定 miRNA 重新编程 ROS 代谢并影响病害结果。细菌病原菌也触发 miRNA 依赖性氧化还原调控，如水稻 miR395 增强 flg22 处理后的 ROS 爆发。病毒改变 miRNA 表达以操纵宿主 ROS 稳态，既可能促进病毒感染也可能增强抗病毒防御。昆虫取食同样诱导 miRNA 依赖性变化，如水稻 miR393a/b 响应褐飞虱侵染调节 RBOHB 依赖性 H₂O₂ 产生。miRNA 还参与有益共生，如番茄 miR408b 在丛枝菌根共生后期下调以促进共生定殖。

非生物胁迫和生物胁迫响应在共同的氧化还原调控组分上反复汇聚，包括 SOD、CAT、APX、POD/PRX、谷胱甘肽相关通路和 RBOH，但区别主要在于上游生理和信号环境。在非生物胁迫下，氧化还原控制与水分状态、离子和营养稳态、光合保护、ABA 信号和代谢调整紧密结合；而在生物相互作用中，许多相同的氧化还原组分被整合到免疫信号和激素信号通路中。共享 miRNA 模块（如 miR398、miR528、miR393）可能作为跨胁迫调控的重要节点发挥作用，但其操作不太可能具有普遍益处——改善一种胁迫耐受的调控状态可能在 ROS 的生理需求发生变化时损害另一种胁迫。因此，胁迫诱导型、组织特异性或靶位点特异性操作可能比组成型过表达或抑制更为合适。

**结论与展望**

miRNA–ROS 互作组的网络架构以重复出现的 miRNA 中心调控模块为基本组织方式。在这些模块中，miR398、miR408、miR528 和 miR169 中心的调控作为一组候选功能枢纽脱颖而出。在拓扑层面，调控分支和功能汇聚在已表征的 miRNA–ROS 通路中显而易见：分子上不同的 miRNA 通路可影响同一更广泛的氧化还原过程，如 RBOH 相关的质外体 ROS 调控通路。几个机制上已解析的通路进一步揭示了反馈和前馈调控的存在。总体而言，现有证据支持一个围绕重复出现的 miRNA 中心模块、实验上已解析的反馈和前馈环、共享氧化还原过程上的功能汇聚以及调控关系的环境依赖性部署而组织起来的 miRNA–ROS 互作组。

**知识空白与未来方向**：当前知识主要基于单模块、单胁迫研究，限制了在田间典型复杂胁迫组合下对网络协调的认识。未来研究应优先关注以下关键领域：（1）整合性多组学方法——结合单细胞和空间转录组学、小 RNA 分析、降解组测序和氧化还原蛋白质组学，以定义因果调控回路而非简单相关性；（2）解析时空动态——亟需时间分辨转录组学和体内氧化还原成像来捕捉 miRNA–ROS 事件的动态序列；（3）ROS 到 miRNA 信号通路的机制解析——揭示氧化还原感知的分子逻辑，包括植物如何区分不同活性物种（ROS/RNS/RSS）以及这些信号如何被选择性转译为特定 miRNA 基因的转录或加工；（4）跨物种的转化和比较验证——在拟南芥和水稻之外的多倍体作物和其他多样化物种中验证 miRNA–ROS 调控原理，转化工作应聚焦于在主要作物优良种质中验证保守模块、鉴定赋予独特耐逆性状的物种特异性模块、开发基于 miRNA 的分子标记、工程化精确 miRNA 调控以及在田间水平弥合实验室发现与实际农业应用之间的差距。