肉鸡传染性支气管炎病毒GI-1与GI-24基因型的致病性、组织嗜性及免疫动态比较研究

《Poultry Science》：Comparative Pathogenesis, Tissue Tropism, and Immune Dynamics of Infectious Bronchitis Virus Genotypes GI?1 and GI?24 in Broiler Chickens

　　

摘要：传染性支气管炎（IB）是一种由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的家禽急性高度接触性呼吸道和肾脏疾病。本研究比较评估了肉鸡中近期鉴定的GI-1和GI-24变异株IBV所诱导的致病性、组织嗜性、病毒排毒、细胞因子动态及体液免疫应答。研究人员通过鼻内和眼内途径对试验鸟（n=90）接种10⁶ EID₅₀/0.1 mL的GI-1（n=30）或GI-24（n=30）病毒，对照组（n=30）接种未接种尿囊液，并在感染后21天（dpi）内进行监测。两种IBV变异株均诱导明显的临床疾病，表现为发热、体重增重减少、严重的呼吸道和肾脏表现。肉眼及组织病理学检查显示，感染鸟的肺和肾脏出现明显的充血、出血、肾小管变性和坏死。实时RT-PCR分析显示，呼吸道和肾组织中病毒载量高且排毒时间延长，持续至21 dpi（P < 0.001），并伴随独特的组织特异性炎症和促炎细胞因子反应，这是首次对GI-24感染后器官特异性和拭子相关细胞因子动态的表征。与GI-24相比，GI-1变异株始终诱导更高且更持久的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α（P < 0.001和P < 0.01）、抗病毒干扰素IFN-γ和IFN-β（P < 0.01）以及调节性细胞因子IL-10（P < 0.01）的表达。两个感染组均产生强大的体液免疫应答，在14 dpi出现血清转化，并在21 dpi达到抗体滴度峰值。总体而言，GI-1比GI-24表现出更强的致病性和更持久的病变，而新出现的GI-24变异株表现出呼吸道和肾脏双重嗜性，并诱导独特的组织特异性细胞因子反应，这是对其免疫病理学的首次详细表征，凸显了持续监测和匹配毒株疫苗接种策略的必要性。

肉鸡传染性支气管炎病毒GI-1与GI-24基因型的比较致病性、组织嗜性与免疫动态研究解读

一、研究背景与目的

传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触性禽类病毒性疾病，对全球养禽业构成严重威胁，造成生产力下降、增重不良和死亡等重大经济损失。IBV属于冠状病毒科（Coronaviridae）γ冠状病毒属（Gammacoronavirus），为长约27.6 kb的单股正链RNA病毒，其基因组编码纤突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣壳（N）等结构蛋白，其中S1亚基是病毒附着、中和抗体诱导及抗原多样性的关键蛋白。由于RNA依赖性RNA聚合酶易错性和频繁重组，IBV呈现高度遗传变异性，导致众多不同基因型和变异株的出现。目前IBV分为七个基因型（GI-GVII）共35个变异株。GI-1基因型（马萨诸塞型）因广泛使用活疫苗而成为全球最常见基因型之一，过去主要与呼吸道疾病相关。GI-24基因型则已在南亚和东南亚地区出现，印度和巴基斯坦均有报道，孟加拉国新近鉴定出与印度参考株密切相关的GI-24毒株。尽管GI-24被认为与嗜肾病变相关，但其组织嗜性和致病性可能因毒株而异，且重组是否导致GI-24组织嗜性改变尚不清楚。在孟加拉国，尽管广泛使用经典疫苗株，传染性支气管炎仍在商品肉鸡群中反复暴发。此前分子鉴定发现GI-24与常用疫苗株在S1高变区和预测中和表位区存在遗传和预测抗原差异，提示潜在抗原漂移和交叉保护降低。然而，对于GI-1和GI-24变异株在当地生产条件下的致病性和免疫学行为缺乏系统的比较实验数据，构成关键知识空白。因此，本研究旨在比较评估从孟加拉国商品肉鸡临床暴发中分离的GI-1（优势循环变异株）和GI-24（新传入变异株）在实验感染肉鸡中的致病性、组织嗜性和免疫应答，为改进IBV防控措施提供循证依据。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员在符合孟加拉国典型开放棚舍生产条件且严格生物安全措施下饲养90只商业肉鸡（Cobb-500），9日龄时经ELISA确认IBV母源抗体阴性，随后随机分为对照组（n=30）、GI-1感染组（n=30）和GI-24感染组（n=30）。10日龄时，经鼻内和眼内途径分别接种10⁶ EID₅₀/0.1 mL的GI-1或GI-24病毒，对照组接种无菌PBS。主要技术方法包括：第一，病毒分离与鉴定，两种IBV分离株（GI-1/B53和GI-24/B60）来自孟加拉国农业大学病理学系，经S1基因序列比对确认基因型，并在9-10日龄SPF鸡胚中传代增殖，测定50%胚胎感染剂量（EID₅₀），传代后S1序列与原始分离株100%一致。第二，临床与病理学评估，每日观察临床症状和死亡率，定期测量体温和体重，在3、5、7、10、14、18、21 dpi进行剖检，记录肺和肾脏肉眼病变，并对肺和肾组织进行苏木精-伊红（H&E）染色组织病理学检查。第三，病毒载量定量，采集口咽和泄殖腔拭子以及呼吸道组织（鼻甲、气管和肺的混合池）和肾组织，使用单步RT-qPCR检测IBV 5‘-UTR和聚合酶基因片段，通过标准曲线计算log₁₀ RNA拷贝数。第四，细胞因子表达分析，利用实时qPCR检测呼吸道组织和肾组织中IL-1β、IL-10、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的mRNA相对表达量，以GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCT方法计算相对倍数变化。第五，体液免疫监测，于7、14、21 dpi采集血清，使用商品化ELISA试剂盒检测IBV抗体滴度，以大于1625为阳性阈值。统计采用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比较检验，P<0.05为差异显著。

三、主要研究结果

（一）临床表现

感染后3 dpi起，GI-1和GI-24感染组均出现显著直肠温度升高，持续至10 dpi，GI-1组发热更明显，峰值达107°F，而GI-24组峰值约105°F，对照组始终维持正常体温（105°F）。体重增重方面，从5 dpi起两个感染组增重显著低于对照组，且该差距持续至21 dpi，对照组总体增重最高，GI-24组居中，GI-1组最低。感染鸡只表现打喷嚏、咳嗽、张口呼吸、鼻液、抑郁、精神沉郁、水样腹泻和多尿等呼吸道和肾脏症状，临床症状在7和10 dpi达到高峰，之后逐渐消失。对照组在整个观察期内无任何临床症状。

（二）肉眼病变

肺脏病变于7 dpi出现并持续至21 dpi。GI-1组在7 dpi出现中度肺充血，10 dpi出现明显充血和肿胀，14 dpi呈现严重充血、渐进性暗变色、局灶性出血和实变，18 dpi仍有明显实变和弥漫性充血，至21 dpi大部分病变消退。GI-24组肺病变相对较轻，7和10 dpi仅见轻度局灶性充血，14 dpi呈暗红色、质地稍硬、表面较光滑，18-21 dpi逐渐消退。肾脏方面，GI-1组从7 dpi起出现轻度肿胀和局灶性充血，10 dpi发展为显著增大、广泛充血和弥漫性暗变色，21 dpi仍见严重充血、斑片状出血和表面不规则，提示慢性病变。GI-24组肾脏病变较轻，10-14 dpi出现轻至中度肿胀和充血，至21 dpi基本恢复正常大小和颜色。对照组肺和肾始终正常。

（三）组织病理学

肺脏组织学检查显示，7 dpi GI-1组表现为明显的血管周围水肿和肺充血，GI-24组为肺水肿伴轻度充血。10和14 dpi两感染组均见相似充血和血管周围水肿，但14 dpi时GI-24组血管周围水肿略突出。18 dpi GI-1组出现慢性支气管炎特征，表现为持续炎症和支气管壁结构改变，GI-24组仅有支气管和血管充血。21 dpi两组均表现慢性支气管炎，支气管壁增厚和慢性炎性细胞浸润。肾脏组织学方面，7 dpi两组均呈现坏死性肾小管肾炎，表现为广泛的肾小管坏死和炎症。10-14 dpi GI-1组持续表现变性性肾小管肾炎，GI-24组肾出血更明显。18 dpi两组均出现退行性改变，但仍见坏死性病变。21 dpi两组均显示明显的再生性改变。对照组肺和肾组织学始终正常。

（四）拭子与组织病毒载量

口咽拭子中，两个感染组于5 dpi开始排毒，10-14 dpi达到峰值。GI-24在5和7 dpi的病毒RNA载量显著高于GI-1（p<0.001），提示其早期上呼吸道复制能力强；14 dpi后两组均下降，但GI-1排毒持续时间略长至21 dpi。泄殖腔拭子中，两感染组于3 dpi即可检出病毒RNA，10-14 dpi达到最高水平；GI-1在整个观察期泄殖腔病毒载量始终显著高于GI-24（p<0.001）。呼吸道组织中，两感染组于3 dpi检出病毒RNA，14-18 dpi达到峰值；早期（3-7 dpi）GI-24病毒RNA浓度显著高于GI-1（p<0.001），18 dpi后下降但仍可检出至21 dpi。肾组织中，两感染组于3 dpi起可检出病毒RNA，14 dpi达到峰值，之后下降但持续至21 dpi；GI-1在5和14 dpi的肾病毒RNA水平显著高于GI-24（p<0.001），其余时间点无显著差异。总体而言，两变异株在肺和肾均能有效复制并持续存在。

（五）体液免疫应答

血清ELISA检测显示，7 dpi时各组抗体滴度均低于截断值；14 dpi两感染组滴度显著升高并超过阳性阈值；21 dpi进一步升高，GI-1组滴度最高，其次为GI-24组，均显著高于对照组（p<0.001）。对照组在整个过程中始终血清阴性。

（六）呼吸道组织细胞因子表达动态

呼吸道组织中，IL-1β表达在14 dpi达峰，GI-1感染组在7、10、14 dpi的表达显著高于GI-24组（P<0.001）。TNF-α在GI-1感染组于10、14、21 dpi显著高于GI-24组（P<0.01），14 dpi表达最高，21 dpi降至最低。IFN-γ在感染后3 dpi起显著上调并持续至21 dpi，早期（至7 dpi）GI-24组表达更高，之后下降；GI-1组则在14 dpi出现更明显的IFN-γ反应，21 dpi逐渐降低。IFN-β在3、5、7 dpi相对稳定，14 dpi出现显著峰值。IL-10在GI-1感染组于10 dpi显著上调（P<0.01），随后逐渐下降，GI-24组呈现类似模式。

（七）肾脏组织细胞因子表达动态

肾组织中，IL-1β表达在10和14 dpi达到峰值，GI-1变异株诱导的IL-1β表达幅度显著高于GI-24（P<0.001）；在3、5、7和21 dpi，所有感染组表达均显著高于对照组（P<0.05），且在3、7、21 dpi两变异株间差异显著（P<0.001）。TNF-α在10 dpi达到峰值，GI-1感染组在所有时间点的表达均一致高于GI-24组（P<0.01）。IFN-γ自3 dpi起显著升高，GI-24组于10 dpi达到峰值，而GI-1组于14 dpi出现延迟峰值，21 dpi均下降。IFN-β在感染早期（3-5 dpi）相对稳定，7 dpi显著升高（P<0.01），GI-1组反应较GI-24组更强。IL-10在GI-1感染组的3、10、14、21 dpi表达显著高于GI-24组（P<0.01）。总体而言，GI-1变异株在呼吸道和肾组织中均诱导更为强烈且持久的促炎和抗病毒细胞因子反应，与更严重的病变和延迟的组织再生相一致。

四、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，孟加拉国养禽业在国民经济和食品安全中占据重要地位，但IBV持续引发暴发导致重大经济损失。本研究发现，GI-1和GI-24感染均引起发热、增重减少和典型呼吸道与肾脏症状，临床表现在7-10 dpi达峰。GI-1感染诱导更严重且持久的肺和肾脏病变，表现为明显充血、实变、慢性支气管炎以及肾肿大、出血、肾小管坏死和延迟再生；GI-24感染虽也产生显著的呼吸道和肾脏病变，但程度较轻且消退更早。病毒载量分析显示两变异株在呼吸道和肾脏均高效复制并经口咽和泄殖腔排毒，GI-24在感染早期呼吸道病毒载量更高，而GI-1在泄殖腔排毒和肾组织中载量更高。研究人员提出，受体分布差异和S1序列差异（如受体结合区替换）可能影响组织嗜性，但该机制仍需进一步验证。血清学结果显示两感染组均在14 dpi血清转化，21 dpi达峰，证实两变异株均具免疫原性。细胞因子动力学表明，GI-1感染诱导更强且持续的促炎（IL-1β、TNF-α）和抗病毒（IFN-γ、IFN-β）反应，与更严重的病变相关；GI-24感染早期IFN-γ升高和IL-10显著上调可能与其较轻的病变和较早恢复相关。肾组织中IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-10的显著上调强调IBV的明显嗜肾性及变异株特异性免疫调节对肾病理的贡献。讨论还强调，GI-24虽传统上被视为嗜肾基因型，但本研究所用孟加拉国GI-24分离株表现出呼吸道和肾脏双重嗜性，且这是首次对GI-24感染后器官特异性和拭子相关炎症/促炎细胞因子反应进行特征描述，为理解该新出现基因型的免疫病理学提供了新见解。

研究结论指出：GI-1和GI-24两种IBV变异株均能在肉鸡中引起显著的呼吸道和肾脏疾病，表现为广泛的组织损伤、长期排毒和强体液免疫应答；但GI-1比GI-24具有更强的致病性，诱导更严重且持久的病变、更高的病毒载量以及更强的炎症和抗病毒细胞因子反应。重要的是，尽管GI-24先前主要被视为嗜肾致病基因型，但孟加拉国GI-24分离株表现出呼吸道和肾脏双重嗜性，提示其组织分布比以往认识的更为广泛。此外，本研究首次详细描述了GI-24感染后器官特异性和拭子相关的炎症及促炎细胞因子反应，为其免疫病理学提供了新见解。这些发现增强了对新出现GI-24变异株生物学行为的理解，并强调持续分子监测、致病性评估和基因型匹配疫苗策略评估对改善家禽生产中IBV防控的重要性。