整合多组织转录组分析鉴定禁食诱导换羽后产蛋恢复相关的Hub基因

《Poultry Science》：Integrated multi-tissue transcriptomic analysis identifies hub genes associated with egg production recovery after fasting-induced molting

　　

禁食诱导换羽被广泛应用于家禽产业，以恢复老龄蛋鸡的生殖系统活力，从而提高换羽后产蛋性能并延长生产寿命。然而，换羽后生殖恢复的个体差异可能影响换羽方案的整体有效性。因此，阐明这种差异背后的分子基础对家禽生产和遗传改良具有重要意义。在本研究中，研究人员根据禁食诱导换羽后的产蛋恢复情况，将蛋鸡分为高恢复（high-recovery, HR）组和低恢复（low-recovery, LR）组。利用RNA测序（RNA-seq）对下丘脑、垂体、卵巢和肝脏进行转录组分析。在HR组与LR组之间，下丘脑、垂体、卵巢和肝脏中分别鉴定出271、435、3,425和289个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。功能富集分析显示，这些DEGs主要与蛋白质稳态、激素应答、核糖体功能和免疫调节相关，表明换羽后恢复期间存在组织特异性的生物学功能。整合加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）和蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析，进一步将HSP90AA1、GDF7、CTSS和STS鉴定为与换羽后生殖恢复相关的候选枢纽基因。综上所述，本研究提供了换羽后产蛋恢复的多组织转录组全景图，并鉴定了可能参与该过程的关键生物学过程和候选基因。这些发现增进了对换羽后生殖恢复分子机制的理解，并为具有优良换羽后性能的蛋鸡遗传改良提供了宝贵的遗传资源。

**研究背景与目的**

强制换羽（induced molting）是商业蛋鸡生产中广泛采用的管理措施，通过禁食、限水及光控等手段诱导鸡群同步换羽，使生殖系统暂时退化后重新发育，从而延长产蛋周期并改善换羽后产蛋性能。然而，实际生产中即使在同一遗传背景和管理条件下，个体间换羽后产蛋恢复仍存在显著差异，部分个体恢复缓慢，导致群体恢复不同步，降低整体生产效率。以往研究多集中于不同换羽方法比较、换羽期生理变化及营养干预等方面，但个体差异的分子机制尚不清楚。蛋鸡产蛋性能受下丘脑-垂体-卵巢（hypothalamic-pituitary-ovarian, HPO）轴和肝脏等多组织共同调控，因此，整合多组织的转录组数据是揭示换羽后产蛋恢复分子机制的重要途径。本研究旨在通过比较高恢复（HR）与低恢复（LR）蛋鸡在禁食诱导换羽后下丘脑、垂体、卵巢和肝脏的转录组差异，鉴定组织特异及共有的分子通路和候选关键基因，为延长蛋鸡产蛋周期和遗传改良提供理论基础。

**研究内容与主要技术方法**

研究人员从贵州黔西南州某养殖公司选取同一批次1084只61周龄健康的海兰灰蛋鸡，在69周龄进行禁食诱导换羽，根据恢复期（72–80周）累积产蛋量，将鸡只分为HR组和LR组，每组各取4只健康母鸡，采集下丘脑、垂体、卵巢和肝脏进行转录组测序（RNA-seq）。主要技术包括：利用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），阈值设为|log₂FC| ≥ log₂(1.5)且Benjamini-Hochberg校正P < 0.05；使用clusterProfiler进行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析；采用WGCNA构建共表达网络，识别组织相关模块；通过STRING数据库和Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并利用cytoHubba的四种拓扑算法（MCC、Degree、Closeness、Betweenness）综合筛选枢纽基因。

**研究结果**

*HR与LR组表型差异明显，表明恢复差异与基础产蛋性能无关*

在换羽前，HR和LR组的63–69周产蛋数（EN63-69w）和69周体重（BW69w）均无显著差异（P > 0.05），表明两组初始生产性能相近。换羽后，HR组恢复首次产蛋时间显著短于LR组（14.13 ± 0.35 d vs 44.38 ± 1.50 d，P < 0.01），72–75周、76–80周及72–80周的产蛋数均显著高于LR组（P < 0.01）。这说明HR和LR组的差异并非源于换羽前生理状态，而是由换羽后生殖系统重建的分子调控差异所致。

*转录组测序揭示卵巢是转录重编程最剧烈的组织*

RNA-seq共获得约15.5亿条原始读段，样本平均比对率为96.23%，Q30值介于95.42%–97.75%，数据质量较高。主成分分析（PCA）显示样本主要按组织类型聚类。在HR vs LR比较中，卵巢鉴定出3,425个DEGs（占HPO轴全部DEGs的82.91%），远多于垂体（435个）、肝脏（289个）和下丘脑（271个）。UpSet图显示大部分DEGs具有组织特异性，仅10个DEGs在HPO轴三个组织中共享，包括HSPB8、KIF20A、COL27A1等，提示存在跨组织的共同分子事件。

*功能富集分析显示各组织特异富集的生物学功能*

GO和KEGG富集分析显示：下丘脑DEGs显著富集于蛋白质折叠、分子伴侣介导的蛋白质折叠等蛋白质稳态相关条目，KEGG通路包括内质网蛋白质加工、氮代谢、apelin信号通路和谷胱甘肽代谢；垂体DEGs富集于激素应答和昼夜节律相关条目，KEGG通路包括神经活性配体-受体相互作用、激素信号通路、钙信号通路等；卵巢DEGs富集于核糖体结构组成、胞质核糖体等条目，KEGG通路包括细胞黏附分子、整合素信号通路、凋亡等；肝脏DEGs富集于免疫调节相关条目，KEGG通路包括代谢通路、胰岛素信号通路、PPAR信号通路等。这些结果提示，各组织在换羽后恢复中发挥不同功能。

*WGCNA鉴定出组织相关共表达模块，部分模块与恢复表型相关*

基于全样本中MAD值最高的10,000个基因构建无符号共表达网络，软阈值β=9时符合无标度拓扑（R2>0.80）。共获得6个模块：turquoise（2,737基因）、blue（2,648）、brown（1,971）、yellow（1,473）、green（543）、red（518）。模块-组织关联分析显示：MEgreen与下丘脑正相关（HR: r=0.57, LR: r=0.56），MEred与垂体正相关（HR: r=0.52, LR: r=0.51），MEyellow与卵巢正相关（HR: r=0.52, LR: r=0.53），MEbrown与肝脏负相关（HR: r=-0.45, LR: r=-0.46）。组间比较显示，下丘脑MEgreen在HR组显著高于LR组（FDR=0.0348），卵巢MEyellow在HR组显著低于LR组（FDR=0.0150），而垂体MEred和肝脏MEbrown在两组间无显著差异。这表明特定共表达模块的转录变化与换羽后产蛋恢复能力有关。

*整合DEG、WGCNA和PPI网络分析鉴定组织特异枢纽基因*

将各组织DEGs与对应组织相关模块基因取交集，分别在下丘脑、垂体、卵巢和肝脏得到15、12、197和22个重叠基因。利用STRING构建PPI网络，通过cytoHubba四种算法排名，各组织鉴定出排名前10的枢纽基因，其中关键候选基因包括：下丘脑HSP90AA1、TULP1、C3orf14；垂体GDF7、FZD10、TRPA1；卵巢CTSS、TLR7、RPL12；肝脏STS、PNPLA2、PPARGC1A。进一步结合功能分析，HSP90AA1编码分子伴侣，与蛋白质稳态相关；GDF7属于TGF-β超家族，参与细胞分化；CTSS编码组织蛋白酶S，参与组织重塑；STS编码类固醇硫酸酯酶，参与类固醇激素代谢。这些基因可能在换羽后生殖恢复中发挥重要作用。

**讨论与结论**

讨论部分指出，换羽后产蛋恢复并非单组织调控的结果，而是神经内分泌、生殖和代谢系统协同作用的综合表现。下丘脑以蛋白质稳态维持神经内分泌功能，垂体以激素应答和昼夜节律调节参与生殖调控，卵巢以核糖体合成蛋白质支持卵泡发育和类固醇生成，肝脏则通过免疫和代谢稳态为生殖提供系统支持。四种组织既有分工又互相协同。

研究结论可翻译为：总之，利用来自下丘脑、垂体、卵巢和肝脏的多组织转录组数据，本研究系统表征了禁食诱导换羽后高恢复与低恢复蛋鸡在产蛋恢复方面的分子调控差异。四个组织均表现出组织特异性的转录响应，其中卵巢在恢复期显示出最大程度的转录重编程。功能富集分析揭示了各组织不同的生物学特征：下丘脑主要与蛋白质稳态相关，垂体与激素反应和昼夜节律调节相关，卵巢与核糖体介导的蛋白质合成相关，肝脏与免疫稳态和代谢调节相关。此外，整合差异表达分析、WGCNA和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，本研究鉴定了数个组织特异性的枢纽基因，包括HSP90AA1、GDF7、CTSS和STS。综合多组织转录组分析表明，换羽后产蛋恢复与神经内分泌、生殖和代谢系统的互补分子响应相关。这些发现增进了对蛋鸡换羽后生殖恢复分子机制的理解，并为未来产蛋恢复能力研究和产蛋性能遗传改良提供了候选基因。