散养略阳乌鸡盲肠己酸的年龄依赖性动态及其对原代成肌细胞增殖与凋亡的影响

《Poultry Science》：Age-Dependent Dynamics of Cecal Caproic Acid in Free-Range Lueyang Black-Boned Chickens and Its Effects on Primary Myoblasts

　　

盲肠己酸的年龄依赖性动态及其对鸡成肌细胞的影响仍缺乏表征。研究人员将560只雌性略阳乌鸡分为笼养（cage-reared, CR）和散养（free-range, FR）两种饲养系统，每个系统设7个重复单位，每单位40只。在120、150、180和360日龄采集盲肠样本。利用鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics）和非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）表征了FR鸡中年龄依赖的微生物和代谢特征，同时比较了CR和FR鸡中己酸（caproic acid）的丰度。采用鸡原代成肌细胞（primary myoblasts）评估细胞对己酸的反应。FR鸡盲肠己酸丰度高于CR鸡（P < 0.05）。在FR鸡中，其丰度在150日龄升高，180日龄下降，360日龄再次升高。这些动态与微生物群落组成和预测的碳水化合物加工功能的年龄相关差异相一致。包含己酸的代谢物簇与胸肌产量呈正相关，与脂质相关性状呈负相关。己酸在500 μmol/L处理24和48 h后及100–500 μmol/L处理72 h后降低成肌细胞活力。300或400 μmol/L处理48 h降低EdU掺入以及PCNA和CCND1 mRNA表达及其相应蛋白丰度。它还增加了G₀/G₁期细胞比例并增加细胞凋亡，而培养培养基pH值在各组间无显著差异。p-AMPK/AMPK和p-p38/p38比值升高，而p-ERK/ERK比值降低（P < 0.05）。己酸处理后MYOD1 mRNA表达也升高（P < 0.05）。总之，这些发现将己酸确定为一种年龄响应的盲肠代谢物，在体外对成肌细胞增殖和存活具有直接影响，为鸡盲肠代谢变异与肌细胞反应之间的潜在联系提供了证据。

研究背景：禽肉是优质动物蛋白的重要来源，消费者对肉品质和肌内脂肪沉积等特征的需求日益增加。饲养条件可影响家禽行为、环境暴露、肠道微生物组成和代谢，进而影响胴体和肉品质。散养（free-range, FR）系统允许家禽接触户外环境、进行身体活动并在觅食中摄入植物源物质，区别于笼养（cage-reared, CR）系统。略阳乌鸡（Lueyang Black-Boned, LYB）是一个具有独特胴体和肉品质性状的地方品种。前期研究发现FR与CR系统之间存在肠道代谢和微生物稳态差异，且FR组富集己酸（caproic acid），但己酸在FR系统中的时间变化及其与肌肉相关细胞过程的潜在关系尚不清楚。鸡盲肠是微生物发酵的重要场所，可产生短链和中链脂肪酸。己酸是一种中链脂肪酸，可通过微生物链延长途径产生。肠-肌轴研究提示肠道代谢物可能影响骨骼肌代谢，但多数证据来自非家禽模型。因此，本研究旨在纵向追踪FR略阳乌鸡盲肠己酸的年龄动态，并利用原代成肌细胞评估其直接细胞效应。

研究人员开展了什么研究：研究人员使用560只雌性略阳乌鸡，在70日龄育雏后随机分为CR和FR系统，各7个重复单位，每单位40只。在120、150、180和360日龄采集盲肠内容物，对FR样品进行鸟枪法宏基因组学和非靶向代谢组学分析，同时比较CR/FR己酸丰度。随后分离原代鸡成肌细胞，用不同浓度己酸处理，检测细胞活力、增殖、细胞周期、凋亡及相关信号通路。结论是FR鸡盲肠己酸高于CR，且随年龄呈非单调变化；己酸抑制成肌细胞增殖并促进凋亡，伴随AMPK/MAPK信号改变和MYOD1表达升高。意义在于为肠道代谢变异与肌肉细胞反应之间的联系提供了证据。

主要关键技术方法：样本队列来源为560只雌性LYB鸡，来自陕西龙佳农业科技发展有限公司，同一孵化批次，70日龄后分入CR或FR，每系统7重复，每重复40只；四个年龄点每重复取1只，共每年龄7个生物学重复。技术方法包括：鸟枪法宏基因组测序（Illumina NovaSeq 6000，MEGAHIT组装，DIAMOND比对NR_meta、KEGG和CAZy数据库）；非靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）代谢组学，使用XCMS处理，OPLS-DA和Mfuzz聚类分析；原代成肌细胞分离（12日龄胚胎胸肌），CCK-8、EdU、流式细胞术、RT-qPCR和Western blot等。

研究结果：
1. 盲肠代谢组和己酸丰度的年龄相关变化：通过非靶向代谢组学分析发现，FR鸡各年龄组间代谢谱分离明显，共鉴定出大量差异丰度代谢物；KEGG注释主要涉及次级代谢物生物合成、甘油磷脂代谢等，HMDB分类以脂类和有机酸为主。己酸丰度在FR鸡中高于CR鸡，且在FR内部呈现120→150 d升高、150→180 d下降、180→360 d再次升高的模式。Mfuzz聚类将己酸归入Cluster 3，该簇与胸肌产量呈正相关，与肌内脂肪含量、腹脂率、血清甘油三酯和总胆固醇呈负相关。

2. 年龄依赖性动态和微生物群落成熟：宏基因组分析显示，物种丰富度指数（Observed、Chao1、ACE）无显著年龄差异，但Shannon、Simpson和InvSimpson指数存在年龄差异；Bray-Curtis距离的PCoA和NMDS显示不同年龄群落分离，PERMANOVA确认总体组成差异。LEfSe和随机森林识别出多个年龄判别菌种，K-means聚类将其归为五种年龄相关丰度模式。

3. 微生物多糖降解和代谢的功能转变：25个高变异CAZyme家族呈现不同年龄模式，例如GH3和GH13_9在120 d丰度较高，GH28、GH92和CBM20随年龄增加；Reporter Score显示ABC转运蛋白、磷酸转移酶系统、半乳糖代谢等途径在年龄间有差异。

4. 多组学关联：Spearman相关分析显示，Paraprevotella clara、多种Bacteroides和Prevotella等与己酸丰度负相关，而Massilistercora timonensis、Pseudoflavonifractor sp. An184等与己酸正相关；KEGG途径如萜类骨架生物合成、辅因子生物合成、丙酸代谢等与己酸正相关。

5. 己酸对成肌细胞增殖和细胞周期的影响：原代成肌细胞PAX7染色阳性。CCK-8显示500 μmol/L处理24/48 h或100–500 μmol/L处理72 h降低细胞活力。300和400 μmol/L处理48 h降低PCNA和CCND1 mRNA及蛋白水平，减少EdU阳性细胞比例，并增加G₀/G₁期细胞比例。

6. 己酸对成肌细胞凋亡的影响：RT-qPCR显示BID、FAS、CASP3和BAX mRNA升高；Western blot显示BCL-2蛋白降低、BAX蛋白升高；Annexin V-FITC/PI染色显示早期和晚期凋亡率均增加。

7. 己酸对AMPK/MAPK信号和MYOD1表达的影响：Western blot显示p-AMPK/AMPK和p-p38/p38比值升高，p-ERK/ERK比值降低；RT-qPCR显示MYOD1 mRNA表达升高。

讨论与结论：讨论部分指出，FR鸡中己酸的非单调年龄动态可能与雌鸡生殖成熟等生理变化有关，但未直接测量这些因素；微生物群落变化表现为组成和均匀度重排而非物种数增减。CAZyme和KEGG途径变化支持碳水化合物加工和发酵环境的年龄依赖性重组。相关菌种为链延长提供了生态线索，但不能确证因果关系。体外实验中，培养液pH在各浓度间无差异，提示观察到的细胞效应并非由pH变化引起；G₀/G₁积累伴随凋亡，不能解释为终末分化。研究局限性包括未记录重复水平采食量、未匹配饲养密度，因而CR与FR比较反映的是综合饲养背景。研究结论为：这项研究扩展了先前CR与FR的观察，证明FR鸡盲肠己酸丰度更高且在FR系统内随年龄变化；这些时间变化与盲肠微生物组成、预测功能潜力和代谢谱的年龄相关变异一致；在培养液pH无差异的条件下，己酸暴露改变了原代鸡成肌细胞的活力、增殖相关反应、细胞周期分布、凋亡相关标志物及AMPK/MAPK信号；这些发现支持鸡盲肠己酸动态与肌肉相关细胞反应之间存在潜在联系。需要靶向体内干预和功能验证来确定己酸在肠-肌通讯和肌肉表型中的因果作用。