《Journal of Dairy Science》：Comparative phenotypic analyses of healthy Holstein calves and calves with large offspring syndrome derived from in vitro-produced embryos
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体外胚胎生产（in vitro embryo production, IVP）是一种奶牛产业中常用的繁殖技术，用于最大化优秀种畜的遗传贡献等多种目的。然而，IVP常与大 offspring 综合征（Large Offspring Syndrome, LOS）发
体外胚胎生产（in vitro embryo production, IVP）是一种奶牛产业中常用的繁殖技术，用于最大化优秀种畜的遗传贡献等多种目的。然而，IVP常与大 offspring 综合征（Large Offspring Syndrome, LOS）发生频率增加相关，导致犊牛死亡率高、动物福利问题和经济损失。LOS是犊牛的一种发育障碍，其特征为出生体重和体型异常增大，常伴有器官增大及其他异常。在LOS中经常失调的印记基因中，胰岛素样生长因子2受体（insulin-like growth factor 2 receptor, IGF2R）是受影响最一致的基因之一。因此，本研究的主要目标是对犊牛LOS进行全面表征，包括评估健康和LOS患病犊牛在器官发育、生理参数和组织病理学检查方面的差异，并评估影响患病中国荷斯坦犊牛中该综合征表达的因素。研究人员收集了4,584头IVP来源荷斯坦犊牛的出生体重、健康状况和妊娠期数据并用于分析。随后，根据出生体重鉴定出17头LOS患病犊牛。使用一般线性模型和t检验，将这些犊牛的数据与6头健康犊牛在器官重量、血液生化参数和病理变化方面进行统计学比较。结果表明，IVP来源犊牛的平均出生体重为40.79 ± 6.69 kg。出生体重在33至47 kg范围内时，健康犊牛比例最高（86%），而当出生体重超过61 kg时，该比例降至18.4%。此外，出生体重受产犊季节、胚胎冷冻保存方法、卵母细胞采集季节、犊牛性别、牧场和公牛父亲的显著影响。比较分析显示，LOS患病犊牛的体重显著增加，同时心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和舌头均大于健康犊牛。LOS组的白蛋白（ALB）显著高于对照组，而LOS组的谷胱甘肽（glutathione）显著低于对照组。组织病理学检查发现，LOS患病犊牛肺部出现间质性肺炎，肝脏门管区出现炎性浸润。据研究人员所知，这是首项为中国IVP来源荷斯坦犊牛建立LOS诊断定量表型数据库的研究。本研究系统揭示了LOS犊牛多器官肥大、功能异常和病理改变的协调特征。这些发现为犊牛LOS诊断、管理实践以及降低荷斯坦犊牛LOS发生率的遗传选择提供了详细的背景信息。
**体外生产胚胎来源的荷斯坦犊牛与大 offspring 综合征患病犊牛的比较表型分析：一项大规模群体研究**
**一、研究背景与意义**
体外胚胎生产（in vitro embryo production, IVP）作为一种重要的辅助生殖技术，在现代奶牛育种体系中发挥着日益关键的作用，特别是结合活体采卵（ovum pick-up, OPU）和体外受精（in vitro fertilization, IVF）技术，能够最大限度地传播优良母牛的遗传物质，加速群体遗传进展。据国际胚胎移植学会（IETS）统计，2023年全球牛IVP胚胎数量增长了15.8%，中国相关的IVP数据也首次被报告。然而，随着IVP技术的广泛应用，其伴随的犊牛大 offspring 综合征（Large Offspring Syndrome, LOS）发生率增加等问题日益凸显，造成犊牛死亡率升高、动物福利受损和经济损失。LOS是一种以出生体重和体型异常增大为特征的发育障碍，常伴有器官增大等异常，其根本原因是早期胚胎发育过程中的表观遗传重编程错误，特别是印记控制区甲基化异常导致的印记基因表达失调，如胰岛素样生长因子2受体（insulin-like growth factor 2 receptor, IGF2R）表达下调。目前，针对中国IVP来源荷斯坦犊牛群体，尚缺乏系统性的LOS诊断标准和流行病学数据。因此，本研究旨在对IVP来源荷斯坦犊牛的LOS进行全面表征，比较健康与LOS患病犊牛在器官发育、生理参数和组织病理学方面的差异，并评估影响该综合征表达的因素，以期为LOS诊断、牧场风险预警和遗传选择提供科学依据。
**二、研究方法概述**
本研究于2023年6月至2024年5月在中国山东省某奶牛集团下属的10个大型商业化牧场开展，所有牧场饲养规模均超过10,000头荷斯坦奶牛，并采用一致的饲养管理规程。所有IVP操作由同一技术团队完成以保证一致性，所有胚胎均来源于性别鉴定冷冻精液，共收集4,584条IVP来源犊牛的完整生产记录。研究人员基于群体标准差对出生体重进行分级，并采用一般线性模型（general linear model, GLM）分析牧场、产犊季节、胚胎移植类型、卵母细胞采集季节、犊牛性别和公牛父亲等因素对出生体重和妊娠期的影响。根据严格的LOS筛选标准（出生体重≥60 kg且至少具有一项LOS表型特征），鉴定出17头LOS患病犊牛，并选取6头健康的IVP来源犊牛作为对照组。对两组犊牛进行尸体剖检，测量各器官湿重，计算相对器官重量；对肺脏、肾脏、肝脏、心脏、脾脏和肌肉组织进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色组织病理学检查；采用自动生化分析仪和酶免疫分析法测定血浆生化参数和血清激素水平。
**三、主要研究结果**
**1. IVP来源犊牛的出生体重和妊娠期描述性统计及影响因素**
对4,584头IVP来源犊牛的分析显示，群体平均出生体重为40.79 kg，标准差为6.69 kg，范围为12至91 kg；平均妊娠期为277.7天，范围为256至314天。出生体重超过群体均值2个标准差（>54 kg）的犊牛中，死亡或淘汰比例占群体的3.01%；超过3个标准差（>61 kg）时，该比例为1.35%。出生体重与犊牛健康状况呈明显的非线性关系：当出生体重在33-46 kg范围内时，健康犊牛比例最高（86%），死亡率和淘汰率最低；而当出生体重超过54 kg时，健康比例急剧下降，在≥61 kg组中仅18.4%的犊牛健康，死亡率高达46.0%。妊娠期分析显示，270-276天为最适妊娠期范围，健康犊牛比例达85.0%；妊娠期过短（<262天）或过长（≥298天）均导致健康比例显著降低。此外，产犊季节、胚胎冷冻保存方式、卵母细胞采集季节、犊牛性别、牧场和公牛父亲均显著影响出生体重和妊娠期。春季产犊的犊牛出生体重最高，夏季最低；新鲜胚胎移植来源的犊牛出生体重和妊娠期均显著高于冷冻胚胎移植来源的犊牛。
**2. LOS患病犊牛与健康犊牛的组织器官表型和形态学差异**
LOS患病犊牛的出生体重（65.64 ± 6.06 kg）极显著高于健康犊牛（44.25 ± 2.70 kg）。除大脑外，LOS组的体重、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、脾脏和舌头的绝对重量均显著增加。经出生体重校正后的相对器官重量分析显示，LOS组肝脏（2.73% vs. 2.20%）、肾脏（0.70% vs. 0.49%）和肺脏（2.13% vs. 1.13%）的相对重量仍显著高于对照组，而相对脑重量显著低于对照组，表明肝脏、肾脏和肺脏的增大程度超越了单纯体重增加所预期的范围，是LOS中器官特异性肥大的关键靶器官。组织病理学检查发现，LOS患病犊牛肺脏出现肺泡扩张、肺泡间隔增宽和炎性细胞浸润等典型间质性肺炎特征；肾脏出现间质炎性细胞浸润、肾小球萎缩、肾小管结构丧失及上皮细胞坏死脱落等病变；肝脏门管区出现炎性浸润。
**3. LOS患病犊牛与健康犊牛的血浆生化参数和激素水平比较**
血液生化分析显示，LOS组的白蛋白（ALB）水平显著高于健康组（29.97 vs. 27.65 g/L），而谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著低于健康组（671.71 vs. 851.79 U/mL）。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和总抗氧化能力（T-AOC）虽未达显著差异，但均呈现LOS组低于对照组的趋势。生长激素（GH）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）、去甲肾上腺素（NE）和花生四烯酸乙醇胺（AEA）等激素水平在两组间均无显著差异，但LOS组均略低于对照组，其中AEA的差异接近显著（P = 0.06）。
**四、讨论与结论**
本研究通过大规模群体数据结合系统的病理学和生理学分析，首次定义了中国IVP来源荷斯坦犊牛LOS的定量表型特征和相关因素。研究发现，出生体重与犊牛产后健康结局呈非线性关系，33-47 kg为最适出生体重范围，270-277天为最适妊娠期范围。多因素分析揭示了产犊季节、胚胎移植类型、卵母细胞采集季节、公牛父亲等对犊牛出生性状的显著影响，提示环境因素和生物学因素共同塑造IVP犊牛的出生特征。
LOS患病犊牛表现出的多器官肥大特征与人类贝克威斯-威德曼综合征（Beckwith-Wiedemann syndrome, BWS）的表型相似，两者的发病机制均与印记基因表达失调密切相关，这为研究IVP技术安全性提供了重要的比较医学视角。器官特异性分析确定了肝脏、肾脏和肺脏为LOS的主要靶器官，其相对重量的显著增加提示这些器官在LOS病理生理过程中可能扮演关键角色。肺脏和肝脏的炎性病理改变进一步表明，IVP可能通过影响胎儿器官发育的微环境，诱导局部的炎症反应。抗氧化指标GSH-Px的显著降低提示LOS犊牛可能存在氧化应激状态。
综上所述，本研究建立的定量表型数据库和风险阈值可为牧场提供切实可行的早期预警工具，并为优化体外胚胎培养体系、开展针对性的遗传选择以及深入探究LOS的表观遗传机制奠定了重要基础，对提高IVP技术在奶牛产业中的安全性和经济性具有重要意义。
