梨果实木质化与石细胞形成的新调控模块：PpbZIP4-PpHCT32

《Journal of Agriculture and Food Research》：A PpbZIP4-PpHCT32 regulatory module underlying lignification and stone cell formation in pear fruit

　　

梨（Pyrus spp.）是一种具有重要经济价值的水果作物，以其独特的风味、营养品质和消费者接受度而备受青睐。果实质地是梨果营销过程中决定品质的最重要因素之一。与苹果、桃等其他蔷薇科（Rosaceae）果实不同，梨果实发育伴随着独特的木质化（lignification）过程，该过程导致大量石细胞（stone cell）的形成。石细胞簇的大小、分布和丰度直接影响果肉质地和食用品质。过量的石细胞沉积会导致果肉粗糙、口感沙砾感明显，并对风味相关代谢物的积累产生负面影响，从而降低果实品质和市场价值。从细胞学角度来看，石细胞起源于薄壁细胞，其特征是广泛的次生细胞壁增厚和木质素沉积。因此，阐明木质素生物合成和石细胞形成的分子机制对于改善梨果实质地和整体品质至关重要。 木质素是次生细胞壁的主要成分，是一种通过苯丙烷代谢途径（phenylpropanoid pathway）合成的芳香族杂聚物。其生物合成始于苯丙氨酸的脱氨基作用，并经过一系列酶促反应，包括羟基化、甲基化和氧化聚合，最终产生主要由愈创木基（guaiacyl，G）和紫丁香基（syringyl，S）单元组成的复杂聚合物。该过程由一系列结构酶催化，如苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase，4CL）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）和过氧化物酶（peroxidase，PRX）。前人研究表明，特定酶家族成员的表达丰度与梨果实石细胞含量密切相关。其中，羟基肉桂酰辅酶A莽草酸羟基肉桂酰转移酶（hydroxycinnamoyl-CoA shikimate hydroxycinnamoyl transferase，HCT）在木质素生物合成途径中占据关键位置，通过将代谢流导向单木质醇（monolignol）的产生来发挥作用。已有研究表明，HCT基因受木质化相关转录因子调控。在拟南芥中，HCT受NAC-MYB调控层级控制，而在梨中，PbMYB73与PbNAC47和PbAGL7协同激活PbHCT17。然而，梨中其他HCT家族成员在石细胞形成中的功能及其上游调控机制仍不清楚。 木质素生物合成基因的表达受到转录因子（transcription factor，TF）的精确而复杂的调控。在梨中，NAC和MYB家族成员被认为是控制次生细胞壁增厚的主开关。例如，PbrMYB169不仅直接激活Pbr4CL和PbrCAD的表达，还与PbrNSC和PbrMYB169形成正反馈环，协同增强石细胞壁的木质化。PbNAC47和PbMYB73通过形成蛋白复合物协同激活下游靶基因，从而促进石细胞形成。相比之下，尽管碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，广泛参与胁迫响应和发育调控，但它们在果实木质化中的作用仍知之甚少。迄今为止，仅报道PbZIP48参与激活苯丙烷途径基因，而其他bZIP成员是否以及如何通过与结构基因的相互作用来微调梨石细胞形成，在很大程度上仍是未知的。 对具有对比性石细胞含量的梨品种进行比较分析，为解析木质化和果实质地形成的遗传基础提供了有效途径。‘砀山酥’（Pyrus bretschneideri，DS）是中国最重要、栽培最广泛的梨品种之一，而‘幸水’（Pyrus pyrifolia，XS）是日本领先的梨品种，在东亚具有重要的商业价值。这两个品种是两大类栽培梨的代表性品种，但它们在石细胞含量和果实质地方面存在显著差异。前人研究表明，石细胞和木质素通常在果实核心周围积累更丰富，并向外层果肉递减，其中DS表现出相对较高的积累，而XS始终表现出较低水平。它们在果实发育过程中对比鲜明的木质化特征为阐明梨果实石细胞形成和果实品质性状的分子机制提供了理想系统。 在本研究中，研究人员进行了跨多个发育阶段的比较转录组分析，并整合加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）来识别与石细胞积累相关的基因模块。研究人员鉴定了一个此前未被表征的bZIP转录因子PpbZIP4，并证明其通过直接激活PpHCT32表达来正向调控木质素积累和石细胞形成。这些发现揭示了一个控制梨果实木质化的新型PpbZIP4-PpHCT32调控模块，为果实质地形成的分子基础提供了新见解，并为通过分子育种改善梨果实品质和降低石细胞含量提供了潜在分子靶标。

一、研究背景与科学问题

梨（Pyrus spp.）作为重要的经济水果作物，其果实品质直接决定市场价值。与苹果、桃等蔷薇科果实不同，梨果实发育伴随独特的木质化过程，导致大量石细胞形成。石细胞簇的大小、分布和丰度直接影响果肉质地和食用品质，过量沉积会造成果肉粗糙、口感沙砾感明显，并影响风味相关代谢物积累。从细胞学角度看，石细胞起源于薄壁细胞，以广泛的次生细胞壁增厚和木质素沉积为特征。木质素是次生细胞壁的主要成分，通过苯丙烷代谢途径合成，由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、肉桂醇脱氢酶（CAD）和过氧化物酶（PRX）等一系列结构酶催化。其中，羟基肉桂酰辅酶A莽草酸羟基肉桂酰转移酶（HCT）在木质素生物合成途径中占据关键位置，将代谢流导向单木质醇产生。已有研究证实HCT基因受木质化相关转录因子调控，但梨中多数HCT家族成员在石细胞形成中的功能及其上游调控机制仍不清楚。此外，bZIP转录因子家族虽广泛参与植物胁迫响应和发育调控，但其在果实木质化中的作用研究甚少。因此，阐明木质素生物合成和石细胞形成的分子调控机制，对改善梨果实品质具有重要科学意义和应用价值。

二、研究内容与主要结论

研究人员选用石细胞含量差异显著的‘砀山酥’（Pyrus bretschneideri，DS）和‘幸水’（Pyrus pyrifolia，XS）两个栽培品种，通过比较转录组分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）等手段，鉴定出与石细胞积累高度相关的“Yellow”基因模块，并从中筛选出两个关键候选基因：编码羟基肉桂酰转移酶的结构基因PpHCT32和bZIP家族转录因子PpbZIP4。功能研究表明，PpbZIP4定位于细胞核，具有转录激活活性，过表达PpbZIP4促进梨果实、梨愈伤组织和拟南芥中的木质素积累及次生细胞壁增厚，而沉默或抑制PpbZIP4则产生相反效果。同样，PpHCT32过表达在梨果实、梨愈伤组织和拟南芥中均显著提高木质素含量并促进次生细胞壁形成。机制研究通过酵母单杂交（Y1H）、凝胶迁移率变动分析（EMSA）和双荧光素酶报告基因实验证实，PpbZIP4可直接结合PpHCT32启动子中的特异性顺式作用元件（TATGATTACCTGGAA）并激活其转录。共浸润实验进一步表明，沉默PpHCT32可部分减弱PpbZIP4过表达引起的木质素、绿原酸和总酚含量增加，证明PpHCT32是PpbZIP4介导木质化途径的重要下游组分。此外，PpbZIP4和PpHCT32的调控效应还延伸至苯丙烷代谢的其他分支，影响绿原酸和总酚含量。该研究揭示了PpbZIP4-PpHCT32调控模块控制梨果实木质化的新机制，为改善梨果实质地、降低石细胞含量提供了潜在分子靶标。

三、主要关键技术方法

研究人员在南京农业大学白马教学科研基地采集5年生DS和XS梨树果实，于花后30、55、70、85、100和115天六个发育阶段取样，每个阶段从5棵树上采集果实，设置三次生物学重复。主要技术方法包括：比较转录组分析（RNA-seq）结合WGCNA共表达网络分析；间苯三酚-HCl组织化学染色、石细胞分离和乙酰溴法木质素定量；qRT-PCR基因表达分析；梨果实农杆菌介导的瞬时转化和病毒诱导基因沉默（VIGS）；梨愈伤组织和拟南芥稳定遗传转化；GFP融合蛋白亚细胞定位分析；酵母双杂交（Y2H）转录激活活性检测；酵母单杂交（Y1H）、凝胶迁移率变动分析（EMSA）和双荧光素酶报告基因实验验证蛋白-DNA相互作用。

四、研究结果

3.1 DS和XS石细胞和木质素积累模式差异：间苯三酚-HCl染色显示，花后30-55天DS果实切片在果心和维管束区域呈现强烈红色染色信号，表明大量木质素沉积，而XS染色信号明显较弱且分布稀疏。石细胞含量测定表明两品种均呈“先增后减”趋势，花后55天达到峰值，DS石细胞含量达9.4%，约为XS（3.8%）的2.5倍。木质素含量变化趋势与石细胞含量高度一致，DS在花后30-100天持续显著高于XS。

3.2 基于比较转录组学鉴定梨果实石细胞形成关键调控基因：四个发育阶段差异表达基因（DEG）分析显示，花后55天（S2期，石细胞合成高峰期）DEG数量最多，达12973个。维恩图分析鉴定出3491个在所有阶段持续差异表达的基因。WGCNA分析鉴定出与石细胞含量（r=0.9）和木质素含量（r=0.77）极显著正相关的“Yellow”模块，该模块富集于“生物合成过程调控”和“芳香族化合物生物合成过程”。结合基因组注释和转录因子注释，鉴定出结构基因PpHCT32和bZIP转录因子PpbZIP4为关键枢纽基因。qRT-PCR验证表明两基因在DS中表达显著高于XS，均在S2期达峰值，并在8个栽培品种中验证了其表达与木质化程度的相关性。

3.3 PpbZIP4正向调控木质素生物合成和次生细胞壁增厚：系统发育分析显示PpbZIP4与蔷薇科物种bZIP蛋白聚为一支。亚细胞定位实验证实PpbZIP4-GFP融合蛋白定位于细胞核。梨果实瞬时过表达PpbZIP4增强木质素染色信号并显著提高木质素含量，VIGS沉默则产生相反效果。基因表达分析显示，PpbZIP4过表达显著上调PpPAL2、PpHCT32、PpLAC1、PpCAD、PpCOMT26、PpC3H1、PpC3H2和PpCCoAOMT表达，沉默则显著下调多数基因。梨愈伤组织稳定转化实验证实PpbZIP4过表达提高木质素含量，反义抑制则降低。拟南芥异源过表达PpbZIP4显著提高花序茎木质素含量，甲苯胺蓝染色显示维管区域扩大、木质部和束间纤维细胞次生壁增厚。

3.4 PpHCT32是参与木质素生物合成的关键酶基因：梨果实瞬时过表达PpHCT32增强木质素沉积，VIGS沉默则减弱。梨愈伤组织稳定过表达PpHCT32使木质素含量显著提高。拟南芥异源过表达PpHCT32显著提高茎木质素含量，组织学分析显示木质部区域扩大、次生细胞壁明显增厚。此外，PpHCT32过表达显著提高绿原酸和总酚含量，沉默则降低。

3.5 PpbZIP4直接结合PpHCT32启动子并激活其转录：酵母转录激活实验证实PpbZIP4具有内在转录激活活性。Y1H实验证明PpbZIP4可在酵母细胞中结合PpHCT32启动子。EMSA实验证实PpbZIP4-His蛋白可特异性结合PpHCT32启动子中的顺式作用元件（TATGATTACCTGGAA），核心序列突变后结合消失。双荧光素酶报告基因实验表明PpbZIP4使PpHCT32启动子活性提高约3倍。梨果实共浸润实验显示，沉默PpHCT32显著减弱PpbZIP4过表达引起的木质素、绿原酸和总酚含量增加，证明PpbZIP4的调控效应部分依赖于PpHCT32。

五、讨论与结论

讨论部分指出，木质素沉积在植物中具有不同的生物学效应，维管组织中木质化有助于水分运输和机械支撑，而梨果肉中特化厚壁组织细胞的过度木质化则导致石细胞形成和粗糙口感。PpbZIP4和PpHCT32在DS和XS之间存在差异表达和启动子序列多态性，提示顺式调控变异可能贡献于品种特异性表达，但因果贡献尚需实验验证。PpbZIP4的鉴定扩展了对bZIP转录因子参与梨果实木质化的认识。PpHCT32对PpbZIP4过表达和沉默均表现出一致响应，并经Y1H、EMSA和双荧光素酶实验验证为PpbZIP4的直接下游靶基因。绿原酸含量随PpbZIP4和PpHCT32的操纵而平行变化，表明该模块的调控效应可能延伸至苯丙烷代谢的其他分支。PpbZIP4与经典NAC-MYB木质化调控网络的关系尚不清楚，可能通过调控NAC/MYB因子或与其形成蛋白复合物参与更高层次的木质化调控网络。

研究结论：本研究鉴定了一个参与梨果实木质化和石细胞相关次生细胞壁形成的PpbZIP4-PpHCT32调控模块。功能分析表明PpbZIP4和PpHCT32均正向调控木质素积累，而沉默PpHCT32可部分减弱PpbZIP4过表达的效应。机制上，PpbZIP4直接结合PpHCT32启动子并激活其转录。此外，PpbZIP4和PpHCT32的操纵也改变了绿原酸和总酚含量，表明该模块可能协调木质素生物合成与苯丙烷代谢的其他分支。这些发现扩展了对梨果实木质化转录调控的理解，并为改善果实质地和品质提供了潜在分子靶标。