Crz1-like蛋白FolSrz1通过维持细胞稳态促进Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici的氧化应激抗性与致病性

《Journal of Agriculture and Food Research》：The Crz1-like protein FolSrz1 contributes to oxidative stress resistance and virulence through maintenance of cellular homeostasis in Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

　　

Crz1类似蛋白FolSrz1通过维持细胞稳态促进尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici，Fol）的氧化应激抗性和致病性。研究人员发现FolCrz1和Crz1类似蛋白FolSrz1具有不同的生物学功能；FolCrz1介导钙信号传导，其定位依赖于钙调磷酸酶（calcineurin）；FolSrz1对氧化应激抗性和致病性至关重要；FolSrz1调控Fol中与细胞稳态相关的通路；由FolSrz1维持的细胞稳态支持寄主定殖。

研究背景与问题：番茄枯萎病由土传真菌尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici，Fol）引起，病菌通过根部侵染并定殖维管束，最终导致植株死亡。由于厚垣孢子抗逆性强且可在土壤中长期存活，该病一旦传入田间便难以清除。在寄主定殖过程中，病菌需要应对寄主来源的活性氧（reactive oxygen species，ROS）胁迫和营养限制，并通过转录因子介导的转录重编程维持细胞稳态。钙调磷酸酶（calcineurin）是保守的Ca²⁺/钙调蛋白（calmodulin，CaM）激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，其下游锌指转录因子Crz1广泛参与真菌生长、胁迫应答和致病性。然而，crz1突变体的表型通常弱于钙调磷酸酶突变体，说明还存在其他重要下游底物，但在植物病原真菌特别是Fol中，这类底物的功能仍不清楚。因此，研究人员对Fol中两个Crz1同源蛋白进行了系统功能研究。

研究内容与总体结论：研究人员通过BLASTp搜索在Fol中鉴定到FOXG_00040和FOXG_05246两个Crz1同源蛋白，分别命名为FolCrz1和FolSrz1。FolCrz1是典型的Crz1直系同源蛋白，介导Ca²⁺/钙调磷酸酶信号通路；FolSrz1则是Fusarium属特异的Crz1-like C2H2锌指转录因子。研究发现FolSrz1对氧化应激抗性、膜完整性、厚垣孢子形成和番茄致病性至关重要，而FolCrz1主要参与Ca²⁺信号、细胞壁完整性和戊唑醇耐受性。转录组和基因表达分析提示，FolSrz1主要通过调控DNA修复、泛素-蛋白酶体途径、铜转运和类固醇合成等细胞稳态相关基因的基础表达来维持真菌适应性，而非直接调控抗氧化酶基因。该研究揭示了钙调磷酸酶下游除Crz1外还存在通过维持细胞稳态促进氧化应激抗性和致病性的替代机制。

主要关键技术方法：研究人员以Fol 4287野生型为背景，通过同源重组构建了ΔFolcrz1、ΔFolsrz1突变体及相应回补菌株和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合菌株；利用BLASTp和系统发育分析鉴定同源关系；通过荧光显微观察亚细胞定位；利用RNA测序（RNA-seq）初步筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并用RT-qPCR以3个生物学重复进行验证；采用番茄品种‘Farmer 301’进行根部侵染致病性测定，采用‘Huei-Jiau’品种测定根内H₂O₂含量和真菌生物量；H₂O₂含量用TiOSO₄法检测，真菌生物量用qPCR估算。

主要研究结果：

2.1 鉴定Fol的Crz1同源物：通过BLASTp搜索和系统发育分析，研究人员发现FOXG_00040与典型Crz1蛋白聚在一起，命名为FolCrz1；FOXG_05246与FgCrz1A形成远离典型Crz1的分支，且高置信度同源序列仅存在于Fusarium属，命名为FolSrz1。

2.2 FolCrz1和FolSrz1在生长、形态及Ca²⁺信号传导中的差异作用：在PDA上，ΔFolcrz1的生长和菌落形态与野生型相似，而ΔFolsrz1生长减缓、气生菌丝变薄且菌落呈粉色；Ca²⁺的促生长作用在ΔFolcrz1中减弱、在ΔFolsrz1中增强，说明FolCrz1参与Ca²⁺响应，FolSrz1影响离子胁迫应答。

2.3 FolCrz1调控细胞壁完整性，FolSrz1参与膜完整性：ΔFolcrz1对荧光增白剂（calcofluor white，CFW）耐受性增强，ΔFolsrz1对CFW和十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）敏感性增加，说明二者分别参与细胞壁和膜完整性维持。

2.4 FolCrz1和FolSrz1参与氧化应激应答：ΔFolsrz1对H₂O₂和甲萘醌均高度敏感，而ΔFolcrz1仅对甲萘醌敏感，表明二者在氧化应激应答中的功能既保守又分化。

2.5 FolCrz1与戊唑醇耐受性相关：ΔFolcrz1对戊唑醇敏感性增加，ΔFolsrz1无显著变化，说明FolCrz1参与三唑类杀菌剂耐受性。

2.6 FolCrz1和FolSrz1介导厚垣孢子产生：在土壤提取液诱导条件下，ΔFolcrz1和ΔFolsrz1的厚垣孢子产量分别显著减少至野生型的约31%和6%，但孢子形态和脂质分布正常，说明二者参与厚垣孢子形成诱导而非形态建成。

2.7 FolSrz1而非FolCrz1为番茄侵染致病性所需：根部接种番茄28天后，野生型和ΔFolcrz1的病情严重度分别约为73%和75%，ΔFolsrz1仅为22%；所有接种处理均出现茎维管束褐变，表明FolSrz1对充分致病至关重要，而FolCrz1非必需。

2.8 胁迫条件下FolCrz1和FolSrz1的差异核转位：荧光显微观察显示，FolCrz1-GFP在Ca²⁺处理后转位入核，钙调磷酸酶抑制剂环孢菌素A（cyclosporin A，CsA）可阻断该转位；FolSrz1-GFP在基础条件下主要定位于细胞质，少数菌丝呈现细胞质和细胞核部分共定位，H₂O₂和CsA均不改变其定位模式，说明FolSrz1的定位调控不同于典型Crz1。

2.9 转录组分析揭示ΔFolsrz1突变体细胞稳态相关基因表达改变：以|log2FC|≥2且错误发现率（false discovery rate，FDR）<0.05为阈值，RNA-seq共鉴定到1249个DEGs；基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析显示，这些DEGs主要富集于双链断裂修复、泛素连接酶复合体、蛋白酶体蛋白分解、铜离子跨膜转运、核质转运、类固醇生物合成、泛素介导的蛋白水解、自噬和嘌呤代谢等细胞稳态相关通路，而毒力相关基因未见明显差异表达。

2.10 基因表达分析提示FolSrz1主要调控细胞稳态相关基因的基础表达：RT-qPCR验证的12个DEGs中有11个与RNA-seq趋势一致，其中编码Cullin-4A E3泛素连接酶支架蛋白的FOXG_09372以及编码铜转运蛋白Ctr1a和Ctr1b的FOXG_03101、FOXG_13082显著下调；H₂O₂处理后，野生型与ΔFolsrz1之间的表达差异普遍缩小，FolSRZ1自身表达不受H₂O₂诱导，且预测的抗氧化酶基因无一致表达变化，说明FolSrz1主要调控基础条件下的细胞稳态相关基因，而非抗氧化酶基因。

2.11 FolSRZ1缺失不影响受侵番茄根中H₂O₂积累：采用TiOSO₄法测定24小时接种后番茄根中的H₂O₂含量，野生型、ΔFolsrz1和回补菌株处理之间无显著差异，说明FolSRZ1缺失不改变早期寄主ROS积累。

2.12 FolSrz1为番茄根中真菌有效增殖所需：接种5天后通过qPCR估算真菌生物量，ΔFolsrz1在番茄根中的生物量仅为野生型的50.96%，回补菌株恢复至野生型水平，说明FolSrz1是根内高效定殖所必需的。

讨论与结论：讨论部分指出，FolCrz1具备典型Ca²⁺/钙调磷酸酶依赖性转录因子的特征；FolSrz1作为Fusarium属特异的Crz1-like蛋白，其亚细胞定位不受钙调磷酸酶抑制影响，钙调磷酸酶可能通过蛋白稳定性或转录活性而非核转位方式调节FolSrz1。由于ΔFolsrz1中DEGs主要富集于DNA修复、泛素-蛋白酶体途径、自噬和铜转运等细胞稳态相关通路，且Ctr1铜转运蛋白同源基因下调，FolSrz1被认为通过维持基因组完整性、蛋白质稳态和铜稳态来保障真菌在寄主定殖过程中的适应性，从而促进氧化应激抗性和致病性，而非直接调控抗氧化系统。研究结论可概括为：研究人员鉴定并表征了Fol的Crz1同源物FolCrz1和此前未表征的Fusarium属特异性Crz1-like C2H2转录因子FolSrz1；FolCrz1保留了钙调磷酸酶-Crz1信号的保守功能，而FolSrz1已从典型Crz1通路分化，通过维持细胞稳态来保障真菌适应性和致病力。该研究扩展了对钙调磷酸酶下游信号组分的认识，并揭示了通过细胞稳态而非直接调控抗氧化酶系统来促进氧化应激抗性与致病性的替代机制。