《Journal of Agriculture and Food Research》：Degradation and Biotransformation of Licochalcone A by the Human Gut Microbiota: Role of
Bifidobacterium longum subsp.
Suillum AA-55
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人类肠道菌群包含数万亿微生物，其共同编码的代谢能力远超人类基因组。植物源性食物富含对维持人体健康至关重要的生物活性化合物。近年来，多项研究表明肠道菌群显著影响这些化合物在体内的功能。凭借其丰富的酶学能力，肠道菌群可转化多种摄入的天然化合物，包括植
摘要专业翻译
人类肠道菌群包含数万亿微生物，其共同编码的代谢能力远超人类基因组。植物源性食物富含对维持人体健康至关重要的生物活性化合物。近年来，多项研究表明肠道菌群显著影响这些化合物在体内的功能。凭借其丰富的酶学能力，肠道菌群可转化多种摄入的天然化合物，包括植物木脂素、柚皮苷、橙纤维以及强心苷地高辛，并改变其活性与生物利用度。这种影响可使植物来源的天然产物失活或活化，从而改变其生理功能。
甘草（Glycyrrhiza spp.）在全球广泛应用，其提取物富含生物活性黄酮类化合物甘草查尔酮A（Licochalcone A, LCA），常添加于糖果、凉茶和饮料中。LCA是一种查尔酮型黄酮类化合物，由两个芳香环通过α,β-不饱和羰基体系连接而成，羟基和异戊烯基官能团对其生物活性有所贡献。除食品应用外，甘草在传统医学中具有悠久历史，包括中药、阿育吠陀医学和欧洲草药医学。LCA表现出广泛的生物活性，包括抗肿瘤、抗炎、心脏保护和抗氧化作用。值得注意的是，近期小鼠模型研究显示，LCA给药可通过促进有益菌群同时抑制潜在致病菌来显著重塑肠道微生物群落。
近年来，LCA的健康促进作用日益受到关注。研究已证明其对葡萄糖稳态、脂质代谢以及结肠炎等炎症性肠病具有有益作用。这些效应被认为至少部分通过其与肠道菌群的相互作用介导。
LCA经历广泛的肝脏代谢，被人肝微粒体和肝细胞转化为多种I相和II相生物转化产物，其中许多具有独特的药理学特性。尽管科学界对LCA的兴趣日益增长，但负责其肠道代谢的具体肠道微生物仍鲜有表征。迄今为止，仅有少数细菌菌株（包括乳酸双歧杆菌、均匀拟杆菌和卵形拟杆菌）被报道可广泛代谢多酚类化合物；然而，它们特异性降解LCA的能力似乎有限。因此，驱动人类肠道中LCA生物转化的关键微生物物种和酶仍是该领域重要的未解问题。
在本研究中，研究人员旨在系统鉴定能够降解LCA的肠道细菌物种，并阐明该生物转化背后的分子机制。为在群落水平评估LCA降解，研究人员建立了体外厌氧发酵模型，接种来自四名健康年轻男性供体的粪便菌群，从而能够在生理相关的微生物生态系统中表征LCA降解动力学和生物转化产物。随后，研究人员利用基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的代谢物谱分析，筛选了从人类粪便样本中分离的十七株细菌菌株的LCA降解能力，其中长双歧杆菌猪亚种（Bifidobacterium longum subsp. suillum）脱颖而出，成为最高效的降解菌。研究人员进一步进行了全基因组测序和代谢组学分析，以鉴定参与LCA生物转化的遗传决定因素和代谢途径。共培养实验揭示，长双歧杆菌猪亚种作为初级降解菌，通过交叉互养相互作用促进LCA分解并促进卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）和嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）的生长，凸显了LCA代谢在肠道微生物群落中更广泛的生态学意义。最后，研究人员利用小鼠模型结合16S rRNA基因测序，在体内验证了LCA对肠道微生物组成的调节作用。这些发现为人类肠道中LCA代谢提供了新的机制见解，对其作为功能性食品成分和靶向微生物群治疗剂的开发具有重要意义。
论文解读
一、研究背景与科学问题
人类肠道菌群是一个由数万亿微生物组成的复杂生态系统，其集体编码的代谢能力远超人类基因组本身。植物源性食物中富含大量生物活性化合物，对维持人体健康至关重要。近年来的研究日益表明，肠道菌群凭借其丰富的酶学储备，能够转化多种摄入的天然化合物，如植物木脂素、柚皮苷和强心苷地高辛等，从而改变这些化合物的活性与生物利用度。这种微生物介导的转化既可能使植物来源的天然产物失活，也可能将其活化，进而改变其生理功能。
甘草（Glycyrrhiza spp.）在全球范围内被广泛使用，其提取物富含生物活性黄酮类化合物甘草查尔酮A（Licochalcone A, LCA），常被添加于糖果、凉茶和饮料中。LCA是一种查尔酮型黄酮，由两个芳香环通过α,β-不饱和羰基体系连接，羟基和异戊烯基官能团对其生物活性具有重要贡献。LCA表现出广泛的生物活性，包括抗肿瘤、抗炎、心脏保护和抗氧化作用，并在近年被证明对葡萄糖稳态、脂质代谢及结肠炎等炎症性肠病具有有益效果，这些效应被认为至少部分通过其与肠道菌群的相互作用介导。
尽管LCA的肝脏代谢已被广泛研究，其被肝微粒体和肝细胞转化为多种I相和II相代谢产物，但负责LCA肠道代谢的具体微生物物种和酶机制仍鲜有表征。此前仅有少数菌株如乳酸双歧杆菌、均匀拟杆菌和卵形拟杆菌被报道可广泛代谢多酚类化合物，但其特异性降解LCA的能力似乎有限。因此，驱动人类肠道中LCA生物转化的关键微生物物种和相关酶仍是该领域亟待解决的重要科学问题。基于此，研究人员开展了本项系统研究，旨在鉴定能够降解LCA的肠道细菌物种，并阐明其生物转化的分子机制。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员建立了一套整合体外与体内实验的综合研究框架。研究招募了四名居住于中国武汉的健康年轻男性志愿者（年龄24–27岁），排除了近期使用抗生素、益生菌、患有胃肠道疾病或代谢疾病的个体，采集其新鲜粪便样本用于体外厌氧发酵实验。主要关键技术方法包括：体外厌氧发酵模型结合高效液相色谱-串联三重四极杆质谱（HPLC-MS/MS）用于LCA降解动力学和代谢产物分析；气相色谱-质谱联用（GC-MS）用于短链脂肪酸（SCFAs）测定；从粪便样本中随机分离17株肠道细菌菌株，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和16S rRNA基因测序进行鉴定，并逐一评估其LCA降解能力；对高效降解菌株进行全基因组测序及基于COG、KEGG和CAZyme数据库的功能注释；利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）进行非靶向代谢组学分析；采用C57BL/6小鼠模型进行体内验证，结合16S rRNA基因测序（V3–V4区，Illumina NextSeq 2000平台）分析肠道菌群组成变化；通过序贯共培养实验研究菌间交叉互养关系。
三、主要研究结果
3.1 四名健康年轻男性肠道菌群对LCA的体外降解
将四名供体的粪便样本分别接种至LYBHI培养基中进行LCA降解评估。结果显示，不同供体肠道菌群降解LCA的能力存在显著个体间差异。供体A降解效率最高，48小时厌氧发酵后约55%的LCA被降解；供体B表现出中等降解能力（约45%）；供体D降解约35%；供体C降解能力最低，仅代谢约27%的LCA。在发酵过程中，LCA处理组的OD600值始终高于对照组，24小时时LCA组OD600为0.83，显著高于对照组的0.52，表明LCA补充促进了微生物生长。同时，LCA处理组的pH值显著低于对照组，24小时时降至约5.5，而对照组约为6.4–6.5，差异具有统计学显著性。
3.2 体外粪便发酵过程中短链脂肪酸谱的变化
LCA显著促进了发酵过程中总SCFAs的产生。在24小时时，LCA组的总SCFAs浓度较对照组显著升高，其中乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸均显著增加。丙酸和丁酸在24小时时表现出最显著的增幅，提示LCA选择性刺激了与这些有益代谢物产生相关的微生物代谢途径。尽管48小时时多数SCFAs浓度较24小时略有下降，但仍显著高于对照组，表明LCA在整个发酵期间有效增强了肠道微生物的代谢活性。
3.3 肠道菌群将LCA降解为3-羟基甘草查尔酮A
通过LC-MS/MS分析，研究人员在48小时厌氧发酵样本中检测到一个新代谢物。该代谢物呈现m/z 355.2 [M+H]+的质子化分子离子，相对于LCA的m/z 339.1 [M+H]+增加了16 Da，提示发生单羟基化事件。MS/MS谱图分析显示该代谢物与LCA具有相似的碎片模式，表明核心结构骨架得以保留。保留时间分析显示LCA在5.23分钟洗脱，而新代谢物在5.00分钟洗脱，与羟基化后极性增加一致。通过与3-羟基甘草查尔酮A（3-HLA）参考标准比对，其保留时间和MS/MS碎片特征完全匹配，从而将该代谢物鉴定为3-羟基甘草查尔酮A（3-HLA）。
3.4 鉴定负责LCA降解的关键肠道细菌物种
研究人员从人类粪便样本中分离了17株肠道细菌菌株，在厌氧条件下以LCA为主要底物评估其降解能力。结果显示，不同菌株的LCA降解能力差异显著。长双歧杆菌猪亚种（Bifidobacterium longum subsp. suillum）表现出最高的平均LCA降解效率，48小时内达到约90%。大肠杆菌、柯林斯菌、无害梭菌和丁酸梭菌等也表现出较高的降解能力（约80–88%）。相比之下，粪肠球菌、屎肠球菌和普通拟杆菌的降解效率较低，均低于25%。基于其高效的降解特性，长双歧杆菌被选为进一步生长分析的代表性高效降解菌。生长曲线分析显示，在LCA存在下，细菌生物量在前12小时快速增加并达到最大OD值，随后进入稳定期，LCA处理组在对数生长期表现出略强的生长促进效应。
3.5 长双歧杆菌猪亚种AA-55的基因组特征
全基因组测序显示，长双歧杆菌猪亚种AA-55的基因组由一条2,250,570 bp的环状染色体组成，G+C含量为59.76%。基因组注释揭示了紧凑的基因组结构，包含54个tRNA、2个5S rRNA基因、1个16S rRNA基因、1个23S rRNA基因、12个sRNA、5个CRISPR位点、1个Cas基因和1,841个蛋白编码基因。其中161个基因注释至毒力因子数据库（VFDB），118个基因注释至抗生素耐药数据库（ARDB），71个基因注释至碳水化合物活性酶（CAZy）数据库。KEGG通路分析显示大量基因与一般代谢通路相关，特别是碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢以及外源生物降解与代谢。GO功能分类显示注释基因主要与催化活性、代谢过程和分子结合功能相关，其中氧化还原酶相关催化功能高度富集。COG分类显示基因主要分布于碳水化合物转运与代谢（G类）、氨基酸转运与代谢（E类）、能量产生与转化（C类）以及次生代谢物生物合成、转运和分解代谢（Q类）。CAZyme分析鉴定出71种碳水化合物活性酶，包括45种糖苷水解酶、14种糖基转移酶、9种碳水化合物酯酶、2种碳水化合物结合模块和1种辅助活性酶。
3.6 LCA对长双歧杆菌代谢谱的影响
非靶向代谢组学分析显示，LCA暴露诱导了显著且时间依赖性的代谢重编程。主成分分析（PCA）显示对照组（CK）、6小时和24小时组间清晰分离，PC1和PC2分别占总方差的41.00%和21.50%。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示三组完全分离，证实LCA暴露引起了稳健的代谢重编程。以VIP > 1和P < 0.05为筛选标准，6小时时227个代谢物显著上调、582个下调；24小时时280个代谢物上调、675个下调。下调特征在两个时间点均占主导，表明LCA降解过程中胞外代谢物库发生了实质性重构。VIP排名将LCA确定为主要判别变量，同时涉及多种氨基酸衍生物、有机酸和脂质相关代谢物。KEGG富集分析显示差异代谢物主要参与氨基酸代谢、核苷酸代谢和中心碳代谢，包括甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢、半胱氨酸/甲硫氨酸代谢、嘌呤和嘧啶代谢、ABC转运蛋白及三羧酸循环等通路。
3.7 LCA对常规小鼠肠道菌群的影响
16S rRNA基因测序结果显示，与0小时基线相比，6小时时Shannon和Sobs指数显著降低，而后续时间点无显著差异。门水平分析显示，处理后时间点的肠道菌群组成与同一小鼠的0小时基线样本不同，拟杆菌门（Bacteroidota）在6小时和24小时增加，而芽孢杆菌门（Bacillota）在早期阶段减少。属水平分析显示，Muribaculaceae相关谱系在6小时富集，而梭菌纲和毛螺菌科相关类群在0小时更为丰富。在24小时和48小时，Dubosiella、Allobaculum和双歧杆菌属的相对丰度增加。LEfSe分析鉴定了不同时间点的判别性类群，证实LCA给药后肠道微生物组成发生了时间性变化。
3.8 LCA降解菌促进卵形拟杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌的生长
单培养实验显示，在添加LCA的改良YCFA培养基中，长双歧杆菌猪亚种AA-55的OD600显著高于卵形拟杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌，与其更强的LCA降解能力一致，而后两种菌在单独培养时表现出有限的降解能力。序贯共培养实验使用长双歧杆菌在含LCA或载体条件下培养的上清液来培养卵形拟杆菌或嗜黏蛋白阿克曼菌。结果显示，与载体组相比，两种菌在LCA条件培养基中均表现出显著增殖，分别增加2.3倍和3倍。这些发现表明，长双歧杆菌猪亚种降解LCA过程中产生的代谢物促进了卵形拟杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌的生长，揭示了该菌作为初级LCA降解菌和肠道微生物群落内种间生态促进介导者的角色。
四、讨论与结论
本研究通过整合人类粪便发酵、LC-MS/MS代谢物谱分析、菌株水平分离、基因组和代谢组学分析、动物验证及微生物互作研究，证明了LCA经历肠道菌群介导的生物转化，鉴定出3-羟基甘草查尔酮A（3-HLA）为LCA的保守微生物代谢物，并揭示长双歧杆菌猪亚种为强效LCA降解菌。3-HLA在多个粪便供体中的一致性形成表明，LCA转化由保守的微生物能力介导，而非供体特异性代谢活性。LCA补充增加了微生物生物量、增强了SCFAs产生并降低了发酵pH值，表明其刺激了微生物代谢活性。较低的肠道pH通常与更健康的微生物环境相关，有利于有益共生菌同时限制机会致病菌的生长。
长双歧杆菌猪亚种被鉴定为高效LCA降解菌，揭示了双歧杆菌在查尔酮代谢中此前未被认识的作用。基因组注释和多组学分析提示LCA降解与更广泛的细胞适应机制密切相关，但CAZymes在降解模型中的具体作用尚未经实验验证，未来需通过基因敲除模型、酶纯化和异源表达系统来鉴定负责LCA生物转化的具体酶。
研究结果还提示LCA可能通过代谢交叉互养影响肠道微生物群落结构。共培养实验表明，长双歧杆菌降解LCA产生的代谢物促进了卵形拟杆菌和嗜黏蛋白阿克曼菌的生长，表明微生物对LCA的降解可能创造有利于次级消费者的生态位，通过合作性代谢互作重塑群落组成。体内实验进一步证实，LCA口服给药增加了Dubosiella、Allobaculum和双歧杆菌的相对丰度。
研究也存在若干局限性：缺乏载体灌胃对照、未在体内验证SCFAs产生、3-HLA的生物利用度和生物学功能尚待确定、共培养模型可能无法完全反映人类肠道微生物互作的复杂性、以及四名年轻中国男性参与者的较小队列限制了研究结果的普适性。未来研究应纳入适当对照、靶向代谢组学、更复杂的实验模型以及更大更多样化的队列，以阐明LCA介导的肠道菌群调节的生物学相关性。
综上所述，本研究建立了肠道微生物代谢作为LCA生物利用度和生物活性重要决定因素的新认识，为LCA作为功能性食品成分和靶向微生物群治疗剂的开发提供了重要的机制见解和科学依据。
