榄仁树叶及柠檬桉种子和茎提取物的GC-MS分析及对疟疾、登革热和丝虫病媒介蚊虫（双翅目：蚊科）的杀幼虫潜力

《Frontiers in Parasitology》：GCMS profiling and larvicidal potentials of the extracts of Terminalia catappa leaf, Eucalyptus citriodora seed and stem against malarial, dengue and filarial vector mosquitoes (Diptera: Culicidae)

　　

媒介传播感染在全球范围内的扩散，加上昆虫对传统合成杀虫剂防御机制的不断进化，促使研究人员探索生态友好型、源自植物的应对措施。本研究旨在表征榄仁树叶乙酸乙酯提取物（TLEE）、柠檬桉茎乙酸乙酯提取物（LSEE）和柠檬桉种子乙酸乙酯提取物（LEEE）的次生代谢物分布、主要化学成分以及对埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊的杀灭作用。温和环境浸渍法从叶片、种子和茎部获得的提取率分别为TLEE 3.3%、LSEE 2.8%和LEEE 4.7%。标准化幼虫死亡率测定在125至1000 ppm的暴露梯度下于24小时和48小时分别记录了存活动态。初步检测确定了基本化合物类别，气相色谱-质谱联用（GC-MS）分离了TLEE中的各挥发性组分。所有制备的处理均产生了显著且浓度依赖性的幼虫致死效应。针对埃及伊蚊，LSEE表现出优异的致死效率，在24小时时LC₅₀阈值为172.851 ppm。在针对冈比亚按蚊的48小时评估中，TLEE的LC₅₀为13.271 ppm，LSEE的LC₅₀为20.370 ppm，且仅在250 ppm浓度下即实现了100%的完全杀灭率。致倦库蚊在48小时时对LEEE呈现显著敏感性，记录的LC₅₀值为49.090 ppm。鞣质类物质存在于所有样本中，而LSEE和LEEE则特异性地富集了生物碱、黄酮类、树脂和甾体类化合物。TLEE的分析图谱解析出16种不同的化合物。上述指标证实TLEE、LSEE和LEEE具有强大的生物杀虫特性，为抑制目标蚊虫种群提供了可持续、生态安全的替代方案。

**一、研究背景与科学问题**

蚊科（Culicidae）昆虫是全球公共卫生面临的首要威胁之一，作为多种致衰弱病原体的主要传播媒介，其生物学驱动着疟疾、登革热、基孔肯雅热、寨卡和淋巴丝虫病的传播。据世界卫生组织（WHO）2023年报告，疟疾仍是灾难性的疾病负担，2022年记录约2.49亿病例和60.8万例死亡，这一死亡率高度集中在撒哈拉以南非洲和东南亚地区，加剧了现有的社会经济差距。同时，美国疾病控制与预防中心（CDC）指出，登革热已成为全球扩张最快的虫媒病毒性感染，目前已在100多个国家流行。此外，淋巴丝虫病仍是热带地区永久性身体残疾的主要原因之一。这些疾病的持续存在迫切需要开发可持续、无毒且创新的媒介控制干预措施。

历史上，蚊虫种群的管理几乎完全依赖合成神经毒剂，包括有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类。虽最初有效，但密集的选择压力已导致按蚊属、伊蚊属和库蚊属广泛出现杀虫剂抗性。除这些化学药剂的生物学失效外，其使用还与严重的环境退化、食物链中的生物蓄积以及非靶标有益生物的无意灭杀相关。这一化学效能危机已将科研焦点转向植物源生物活性化合物。植物提取物提供多方面的作用模式，同时靶向多种生理途径，显著降低了快速产生抗性的可能性。

榄仁树（Terminalia catappa，印度杏仁）是一种多用途热带树种，因其多样的药理特性而常用于民族医学。其次生代谢物——特别是黄酮类、鞣质和三萜类——已显示出强效生物活性。近期研究表明这些化合物能有效破坏埃及伊蚊和致倦库蚊的幼虫发育。同样，柠檬桉（Eucalyptus citriodora）是已确立的杀虫精油来源，高浓度的香茅醛和异胡薄荷醇赋予其作为驱避剂和杀幼虫剂的双重作用特性。其安全性已获美国环保署（EPA）验证，被归类为综合媒介管理（IVM）的主要生物农药候选物。

尽管榄仁树和柠檬桉叶片的杀虫特性已有充分文献记载，但其种子和茎的杀幼虫潜力在很大程度上尚未被研究。现有科学文献严重偏向叶片测定，对其他解剖结构存在明显的知识空白。此外，现有植物研究常将评估局限于单一蚊种，通常为埃及伊蚊或致倦库蚊。同时针对驱动全球媒介传播疾病的三个不同蚊属进行的全面同步生物测定在当前研究中明显缺失。本研究通过比较评估三种不同植物器官——叶片、种子和茎——以确定具有最高生物杀虫效力的组织，填补了这一空白。

**二、研究内容与核心结论**

研究人员对榄仁树叶乙酸乙酯提取物（TLEE）、柠檬桉茎乙酸乙酯提取物（LSEE）和柠檬桉种子乙酸乙酯提取物（LEEE）进行了系统的杀幼虫活性评价和化学成分分析。研究结果表明，所有提取物均表现出显著的浓度依赖性杀幼虫效果，其中LSEE对埃及伊蚊（Ae. aegypti）展现出最优异的致死效率（24小时LC₅₀ = 172.851 ppm）；在48小时评估中，TLEE对冈比亚按蚊（An. gambiae）的LC₅₀低至13.271 ppm，LSEE为20.370 ppm，且在250 ppm即实现100%完全杀灭；致倦库蚊（Cx. quinquefasciatus）对LEEE最为敏感（48小时LC₅₀ = 49.090 ppm）。植物化学筛选证实鞣质存在于所有样本中，而LSEE和LEEE特异性地富集了生物碱、黄酮类、树脂和甾体类化合物。GC-MS分析从TLEE中解析出16种化合物，以脂肪酸及其甲酯类衍生物为主。这些发现证实三种提取物具有强效生物杀虫属性，为抑制目标蚊虫种群提供了可持续、生态安全的替代方案，为开发新型植物源杀幼虫剂奠定了科学基础。

**三、关键技术方法**

本研究采用以下核心技术方法：（1）**冷浸渍提取法**——以乙酸乙酯为溶剂，对来自尼日利亚埃努古州Trans-Ekulu的榄仁树叶粉及来自贡贝州Billiri Lakokari农场的柠檬桉茎和种子粉（各50 g）进行48小时连续剧烈搅拌提取，经旋转真空蒸发浓缩获得粗提物；（2）**幼虫生物测定法**——参照WHO标准方案，对实验室饲养的埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊四龄幼虫进行125–1000 ppm梯度浓度暴露，每组25只幼虫重复4次，于24小时和48小时记录死亡率，用Abbott公式校正；（3）**定性植物化学筛选**——检测生物碱、黄酮类、皂苷、鞣质、酚类、甾体和萜类等次生代谢物；（4）**气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析**——使用Agilent 7890A气相色谱仪联用5977B质谱检测器，HP-5 MS非极性毛细管柱（30 m × 0.25 mm内径，0.25 μm膜厚），氦气载气恒流1.0 mL/min，程序升温40–250 °C（5 °C/min），全扫描模式（40–650 m/z），化合物经NIST质谱谱库检索鉴定；（5）**统计分析**——采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），Student-Newman-Keuls（SNK）事后检验，概率回归分析计算LC₅₀和LC₉₀值及95%置信区间。

**四、主要研究结果**

**提取率结果**：对统一50 g生物量样本进行冷溶剂浸渍产生不同质量得率：柠檬桉种子提取物（LEEE）效率最高，达4.7% w/w，其次为榄仁树叶提取物（TLEE）3.3% w/w，柠檬桉茎提取物（LSEE）得率最低，为2.8% w/w。

**对埃及伊蚊的杀幼虫活性**：24小时评估中，LSEE是最强毒剂，在1000 ppm产生100%死亡率，LC₅₀值为172.851 ppm；TLEE（LC₅₀ = 2301.608 ppm）和LEEE（LC₅₀ = 1451.160 ppm）短期暴露效力显著较低。延长至48小时显著提升死亡率指数，LSEE的LC₅₀降至144.393 ppm，500 ppm即达100%消除；TLEE效力急剧增强，LC₅₀降至151.260 ppm，最大浓度处致96%死亡率；LEEE的LC₅₀为328.612 ppm。

**对冈比亚按蚊的杀幼虫活性**：24小时评估中，LSEE和TLEE呈现紧密对齐的致死谱，LC₅₀分别为128.461 ppm和148.636 ppm；LEEE效力明显较弱，LC₅₀为766.799 ppm。延长暴露至48小时诱导存活阈值大幅降低，TLEE成为最有效制剂（LC₅₀ = 13.271 ppm），125 ppm低浓度即致96%死亡率，所有更高浓度实现100%幼虫清除；LSEE从250 ppm起同样实现100%死亡率（LC₅₀ = 20.370 ppm）；LEEE的LC₅₀为84.841 ppm。

**对致倦库蚊的杀幼虫活性**：24小时后LEEE和TLEE最初表现优于其他处理，LC₅₀分别为91.433 ppm和106.689 ppm，TLEE在1000 ppm成功清除全部受试群体；LSEE则出现生物活性滞后，125 ppm死亡率仅0%，LC₅₀高达855.023 ppm。48小时时发生效力急剧转变，TLEE效力大幅提升，LC₅₀为20.370 ppm，250–1000 ppm所有浓度均致100%死亡率；LEEE以LC₅₀ = 49.090 ppm进一步巩固表现；LSEE仍为毒性最低变体，最终LC₅₀为302.323 ppm。

**植物化学筛选结果**：鞣质在所有叶片、种子和茎基质中均匀检测到。柠檬桉衍生物（LSEE和LEEE）显示更复杂的代谢谱，富含黄酮类、树脂和甾体类化合物。生物碱仅在茎组织（LSEE）中确认存在，皂苷在所有原始样本中完全缺失。

**TLEE的GC-MS分析结果**：榄仁树叶乙酸乙酯部分的GC-MS分析解析出16个不同的分子峰。挥发性谱以突出的杀虫成分特征为主，包括：脂肪酸及甲酯类[正十六烷酸；9,12-十八碳二烯酸（Z,Z）-；十六烷酸甲酯；10-甲基-十二烷酸甲酯]；杂环及含氮化合物[2-甲基-7-苯基吲哚；7-甲基-7H-嘌呤-6-胺；4-(4-甲氧基苯氧基)-1,2,5-噁二唑-3-胺]等。

**五、讨论与结论**

本研究证实提取溶剂的特定化学极性深刻支配着榄仁树提取物对埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊的粗质量得率及随后的昆虫毒理特性。尽管乙酸乙酯提取物提供了最高质量得率（3.3%），但这一数量丰度与其生物学性能无直接关联，表明蚊虫死亡率由被动员的次生代谢物的精确定性分布和定量密度决定，而非绝对提取物体积。LSEE对埃及伊蚊的最强毒性及TLEE和LSEE对冈比亚按蚊的高效杀灭作用表明，持续暴露促进了活性组分通过幼虫表皮的逐渐渗透，导致重要代谢途径的进行性系统破坏。不同蚊种间显著的敏感性差异可能源于幼虫解毒酶的不同构型、外部表皮通透性差异及物种特异性受体位点敏感性。植物化学筛选证实鞣质、黄酮类、树脂、甾体和生物碱以不同比例局部存在，而皂苷普遍缺失。生物碱通过抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）作为中枢神经系统毒物；黄酮类和鞣质与幼虫中肠消化酶结合，抑制营养同化并诱导氧化应激；皂苷与膜甾醇形成不可逆复合物。GC-MS分析揭示的脂肪酸甲酯类为主的复杂混合物，其亲脂性脂肪酸构型易损害细胞膜完整性并终止能量生产。植物源杀虫剂通常在环境中快速降解，表现出延缓抗性发展的多重作用模式，且对非靶标生物的危害通常小于合成化学品。研究存在一定局限性：仅在实验室条件下进行，环境变量可能影响田间杀幼虫表现；提取物作为复杂混合物评估，各化合物的单独贡献尚不清楚。总体而言，榄仁树和柠檬桉是有效的生物活性植物化学来源，对埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊具有强效杀幼虫活性。LSEE对埃及伊蚊表现出最高效力，TLEE和LSEE对冈比亚按蚊均高效。GC-MS分析和植物化学筛选提示脂肪酸衍生物、黄酮类、鞣质、生物碱、甾体及相关次生代谢物共同驱动了观察到的杀幼虫效应。因此，这些植物提取物作为传统合成杀幼虫剂的生态友好型替代品具有重要前景。未来研究必须聚焦于分离具体活性化合物、探索协同相互作用及评估环境安全性，以推进可持续蚊虫控制策略的发展。