基于mRNA疫苗靶向疟疾裂殖子表面蛋白（PfMSP2）诱导多功能抗体的研究

《Frontiers in Immunology》：Targeting a malaria merozoite surface protein with mRNA vaccine generates multifunctional antibodies

　　

引言： 疟疾是全球范围内疾病负担和死亡率居高不下的重大健康问题。目前获批的疫苗靶向恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的子孢子形式，该形式最初感染肝脏，但对幼儿仅能提供适度的疟疾保护。亟需开发靶向寄生虫多个发育阶段的下一代疟疾疫苗以提高效力。针对参与血液期复制并与临床疾病相关的裂殖子抗体具有多种功能活性，可提供疟疾保护。裂殖子表面蛋白2（PfMSP2）是一个有前景的裂殖子疫苗候选抗原。针对PfMSP2的抗体可促进多种抗体Fc介导的功能活性以清除裂殖子。 方法： 研究人员开发并评估了单价和双价（3D7和FC27变异体）PfMSP2 mRNA疫苗。研究人员设计并进行了密码子优化mRNA，在哺乳动物细胞中验证了体外表达，随后配制成脂质纳米颗粒（LNP），以3剂方案免疫小鼠。同时进行了重组PfMSP2蛋白加佐剂疫苗免疫作为比较。研究人员评估了与保护性免疫相关的抗体诱导及其功能活性。 结果： mRNA疫苗使用单价（3D7等位基因）和双价（3D7和FC27等位基因）疫苗编码近全长PfMSP2，诱导了显著的IgG反应，且抗体可识别完整裂殖子表面。疫苗应答等同于或优于基于重组蛋白的PfMSP2疫苗。双价疫苗对两种PfMSP2等位基因诱导了等效抗体。疫苗接种诱导了嗜细胞性IgG亚类，具有多种功能活性，包括补体固定、人Fcγ受体I和IIa结合以及调理吞噬作用。 结论： PfMSP2在mRNA疫苗平台上具有高度免疫原性，可诱导具有多种与人类保护性免疫相关的功能活性的抗体。将PfMSP2与其他裂殖子和子孢子抗原联合使用，是开发高效疫苗以实现疟疾控制和消除目标的 promising 策略。

论文解读

一、研究背景与目的

疟疾是全球范围内造成重大疾病负担的传染病，分布于83个国家，由按蚊（Anopheles）传播，其中恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是导致全球大多数死亡病例的虫种。世界卫生组织（WHO）估计2024年有超过2.8亿记录病例和近61万死亡病例，其中大多数为5岁以下儿童。自2015年以来，疟疾防控进展停滞，部分原因在于抗疟药物和杀虫剂耐药性的增加。目前获批的疟疾疫苗RTS,S/AS01和R21/Matrix-M均靶向同一子孢子抗原，旨在预防肝期感染，但在幼儿中第一年效力仅为56%至75%，免疫力消退较快，需要年度加强接种，且效力受虫株多样性和人群差异影响。因此，亟需开发靶向寄生虫多个发育阶段的下一代疫苗，以实现全球技术战略（GTS）提出的到2030年将全球疟疾发病率和死亡率较2015年基线降低90%的目标。

裂殖子抗原是疫苗开发的有吸引力的靶点，因其具有减少或预防疟原虫血液期复制的潜力。针对裂殖子的抗体可通过直接抑制裂殖子入侵红细胞以及抗体Fc介导的功能（包括补体固定与激活、与Fc受体相互作用促进调理吞噬和细胞毒性）发挥作用。近期基于PfRh5抗原的领先裂殖子疫苗在幼儿中显示出55%的中等效力（6个月内），其机制为抑制裂殖子入侵。将PfRh5与另一种能针对裂殖子表面产生抗体以促进补体固定、调理吞噬和细胞毒性的裂殖子抗原联合，是获得更高保护性免疫的潜在策略。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2（PfMSP2）是血液期疫苗开发的有前景候选抗原。PfMSP2是裂殖子表面高度丰富的蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于膜上。自然获得的抗PfMSP2抗体在不同人群中与疟疾保护相关。这些抗体可通过Fc区介导补体固定和调理吞噬，从而抑制血液期复制和清除。PfMSP2具有大的可变区（约220个残基），两侧为保守的N端和C端结构域。可变区包含重复的二态序列，产生两个等位基因家族（3D7和FC27）。因此，疫苗中纳入两个主要等位基因可覆盖PfMSP2的多样性。一项含两种等位基因的双价佐剂重组PfMSP2疫苗在未感染疟疾成人中的1期临床试验显示，可显著诱导针对所有恶性疟原虫虫株的多功能IgG。

mRNA-LNP平台具有高效多抗原配方和适应新现虫株的优势，已在SARS-CoV-2疫苗中广泛应用。该平台已在恶性疟原虫和间日疟原虫（P. vivax）的肝期和传播期进行了评估，表明其可用于下一代疟疾疫苗。本研究旨在利用mRNA-LNP平台设计和评估PfMSP2疫苗，以产生针对裂殖子的多功能抗体，为在疫苗设计中纳入可产生Fc介导功能免疫的裂殖子抗原提供概念验证。

二、主要技术方法

研究人员设计并合成了密码子优化的PfMSP2 3D7和FC27序列（GenBank登录号JN248383和JN248384，去除C端多聚组氨酸标签），去除N端分泌信号肽和C端GPI锚定位点。mRNA疫苗使用Moderna的LNP配方（SM-102）。所有mRNA合成、LNP配制和表征由澳大利亚Monash药物科学研究所mRNA核心完成。表达验证使用Expi293F悬浮细胞转染裸mRNA，通过NuPAGE和western blot分析。重组PfMSP2 3D7和FC27由GroPep Pty Ltd（澳大利亚阿德莱德）在大肠杆菌（E. coli）中表达并纯化。动物实验使用雌性C57BL/6小鼠（8-12周龄，每组n=5），mRNA-LNP采用两种方案：固定剂量（3×5 μg）和剂量递增（5 μg、10 μg、15 μg），重组蛋白疫苗采用3×5 μg蛋白加15 μg Quil-A佐剂。小鼠在第0、28、56天通过肌内注射免疫，定期采血。恶性疟原虫3D7培养和裂殖子分离按已发表方法进行。THP-1单核细胞培养和吞噬实验按已优化方案进行。免疫原性通过ELISA评估总IgG、IgG亚类、C1q固定、人FcγRI和FcγRIIa结合。统计分析使用GraphPad Prism 11，采用Mann-Whitney检验、Kruskal-Wallis检验、双因素方差分析和Spearman相关性分析。

三、研究结果

（一）PfMSP2 mRNA疫苗在小鼠中显示出高免疫原性**

研究人员设计了基于3D7等位基因的mRNA疫苗构建体，经密码子优化并截短（Δ19N和Δ23C）以去除N端分泌信号和C端GPI锚定位点，该设计与先前人类临床试验中使用的重组PfMSP2一致。通过western blot证实蛋白表达随时间增加。固定剂量和剂量递增两种mRNA方案在C57BL/6小鼠中均诱导了随每次免疫增加的IgG反应，两种方案间差异极小，表明较高mRNA剂量并非获得最佳IgG诱导所必需。两种mRNA方案的IgG水平在7个月内以相似速率下降。疫苗诱导的抗体可识别完整裂殖子表面的天然PfMSP2，重组蛋白疫苗和mRNA疫苗之间无显著差异。

（二）PfMSP2 mRNA疫苗诱导具有Fc介导功能活性的IgG**

在峰值应答时间点（第70天），三种疫苗方案的IgG亚类谱相当，IgG1水平较高，IgG2b/c中度诱导，IgG3水平低。小鼠抗体对人Fcγ受体（I和IIa）显示出显著结合，这两种受体是促进吞噬和其他功能的激活受体。小鼠抗体还显示出显著的人C1q固定，这是经典补体激活途径的第一步。所有功能活性在各组间大致相当，mRNA固定剂量血清趋向于最高活性。使用mRNA疫苗小鼠血清调理PfMSP2 3D7包被的荧光珠，THP-1人单核细胞系显示出相对于阴性对照的显著吞噬作用，表明Fc受体识别和功能。IgG亚类与Fcγ受体结合之间存在强相关性。

（三）包含两个主要等位基因的双价PfMSP2 mRNA疫苗诱导高功能IgG反应**

研究人员将PfMSP2 FC27等位基因密码子优化并截短（Δ19N和Δ19C），添加C端Myc标签。两个等位基因分别编码为mRNA并配制成LNP后以1:1比例混合，以3×10 μg剂量（每个等位基因5 μg）免疫小鼠。该疫苗对两个等位基因均诱导了高且等效的IgG反应，第三次免疫后抗体滴度最高。双价mRNA疫苗还清晰诱导了功能性小鼠IgG亚类，并通过结合人Fcγ受体和人C1q显示出高功能活性。这些结果表明该疫苗可产生强效且跨虫株的PfMSP2抗体，具有保护性免疫潜力。

四、讨论与结论

讨论部分指出，在哺乳动物细胞中验证PfMSP2表达是推进mRNA疫苗进入临床前动物研究的关键。mRNA-LNP配方对单价和双价疫苗均显示出免疫原性，与佐剂重组抗原疫苗相当。mRNA疫苗体内翻译效率据报道为1-2%，5 μg mRNA-LNP疫苗剂量相当于估计≥100 ng的PfMSP2，而重组蛋白疫苗给予5 μg蛋白。mRNA疫苗免疫原性与重组蛋白疫苗相当，且递增mRNA剂量未改善免疫原性，表明具有剂量节省优势。mRNA疫苗诱导的抗体显示出实质性功能活性，包括补体固定、与FcγRI和FcγRIIa的相互作用以及调理吞噬，这一功能抗体谱与自然获得性免疫和重组PfMSP2蛋白疫苗临床试验中报道的相似。双价配方对两种等位基因形式诱导了相同的抗体反应。研究人员指出，由于PfMSP2或直系同源物不存在于啮齿类疟原虫物种中，且恶性疟原虫不感染啮齿动物，评估PfMSP2疫苗的保护效力需要非人灵长类研究或受控人类疟疾感染（CHMI）。

研究结论为：mRNA-LNP平台可用于单价和双价配方，诱导针对PfMSP2的功能性IgG，进一步支持PfMSP2作为疫苗候选抗原以及靶向裂殖子表面蛋白的疟疾疫苗策略。3剂方案诱导的峰值免疫与佐剂重组蛋白相当。将PfMSP2与PfRh5或其他抗原组合，可能是诱导同时具有生长抑制和Fc介导功能活性抗体的有效策略。进一步，高效血液期疫苗与领先子孢子抗原PfCSP联合，可降低初始感染和后续疾病风险，实现对疟疾的高水平保护。