《Frontiers in Immunology》：Cuproptosis-associated genes DLD, ULK2, CCL8, and CCS link metabolic and immunological dysfunction in Parkinson’s disease: a multi-omics study
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帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种进行性神经退行性疾病，其发病机制涉及代谢功能障碍与神经炎症之间的复杂相互作用。铜死亡（cuproptosis）是一种新定义的铜依赖性细胞死亡途径，在线粒体有氧呼吸过程中被触发，其在PD中的作用尚不
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种进行性神经退行性疾病，其发病机制涉及代谢功能障碍与神经炎症之间的复杂相互作用。铜死亡（cuproptosis）是一种新定义的铜依赖性细胞死亡途径，在线粒体有氧呼吸过程中被触发，其在PD中的作用尚不完全清楚。在本研究中，研究人员对批量RNA测序和单细胞RNA测序数据集进行了整合生物信息学分析，以鉴定与PD密切相关的四个核心铜死亡相关基因（DLD、ULK2、CCL8和CCS）。功能富集和免疫浸润分析将这些基因与PD中的代谢紊乱和免疫景观改变联系起来。单细胞转录组学进一步揭示了这些基因的细胞类型特异性表达模式，并发现推断的细胞间通讯发生改变，尤其是小胶质细胞与星形胶质细胞之间通过NRG信号通路进行的通讯。在AAV9-A53T α-突触核蛋白小鼠模型中进行的实验验证，利用细胞类型特异性多重免疫荧光（mIF）和蛋白质印迹分析，为多巴胺能神经元中DLD水平降低、小胶质细胞中ULK2和CCL8表达减少以及星形胶质细胞中CCS含量降低提供了支持性证据，同时这些细胞群体中FDX1表达增加。这些发现表明，铜死亡相关核心基因的失调与PD中细胞类型特异性的病理改变相关，而非证明直接的因果或协同调控机制。此外，计算机模拟药物-靶点相互作用分析确定了四种靶向这些核心基因相关蛋白的潜在治疗化合物。研究结果表明，铜死亡相关基因失调与PD中的代谢-免疫异常之间存在潜在关联，为进一步验证提供了候选生物标志物和可能的干预靶点。
**论文解读：铜死亡相关基因DLD、ULK2、CCL8和CCS在帕金森病代谢与免疫功能障碍中的多组学研究**
**一、研究背景与科学问题**
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是仅次于阿尔茨海默病的全球第二大常见神经退行性疾病，以运动障碍（运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势步态异常）及多种非运动症状为主要临床表现，给家庭、医疗和社会经济带来沉重负担。PD的典型病理特征为路易小体（Lewy bodies）的形成——主要由异常聚集的细胞内α-突触核蛋白（α-synuclein）构成——以及多巴胺能神经元的进行性丧失。尽管PD的确切病因尚不清楚，但已有研究提出遗传因素、环境因素、饮食、年龄和活性氧应激（ROS）与PD发病密切相关。鉴于PD症状表现的多样性和病因的复杂性，迫切需要识别新的生物标志物或特征以改善PD的早期临床决策。
近年来，多种程序性细胞死亡途径（包括线粒体功能障碍、氧化应激、自噬功能障碍、凋亡、坏死、焦亡和铁死亡）被认为参与PD的神经元死亡进程。铜死亡（cuproptosis）是一种新定义的铜依赖性细胞死亡途径，依赖于线粒体呼吸，其特点是铜离子直接结合导致脂酰化的三羧酸循环（TCA）蛋白聚集，诱导线粒体蛋白毒性应激和代谢崩溃，区别于所有其他已知的程序性细胞死亡机制。铁氧还蛋白-1（FDX1）已被确认为铜死亡的关键上游调节因子，其异常激活导致Fe-S簇蛋白丢失及脂酰化蛋白聚集，进而触发线粒体蛋白脂酰化。此外，铜死亡在包括神经炎症在内的免疫微环境中的重要作用也已被揭示。然而，铜死亡在PD中的具体作用机制尚不完全清楚。因此，研究人员假设铜死亡参与PD的发生和进展，不仅直接诱导神经元死亡，还与线粒体功能障碍和神经炎症相关，可能成为PD的治疗靶点。
**二、研究内容与主要发现**
本研究系统分析和验证了铜死亡与PD之间的关系。通过整合三个批量mRNA数据集的表达谱，研究人员表征了11个差异表达的铜死亡相关基因（DECuAGs）；通过机器学习技术进一步鉴定出与PD发病机制相关的四个核心DECuAGs，并探讨了其功能富集和免疫浸润特征；利用单细胞分析验证了这些核心DECuAGs的细胞特异性表达模式；在成功建立的AAV9-A53T α-突触核蛋白PD小鼠模型中利用多重免疫荧光（mIF）和蛋白质印迹验证了这些表达模式；还研究了与这些核心基因相关的关键细胞的细胞间通讯；最后，作为探索性的下游转化延伸，研究人员进行了基于DSigDB的化合物预测、分子对接和分子动力学模拟，以筛选靶向核心DECuAGs相关蛋白的候选化合物。
研究结果表明，通过整合三个批量转录组数据集（共85例PD患者和85例匹配对照），共鉴定出1487个差异表达基因（DEGs），功能富集分析显示这些基因与“羧酸代谢过程”、“氨基酸代谢”、“线粒体蛋白复合物”、“柠檬酸循环（TCA循环）”、“丙酮酸代谢”和“硫辛酸代谢”等代谢相关通路显著相关。通过将1487个DEGs与46个铜死亡相关基因（CuAGs）取交集，获得11个DECuAGs。进一步通过三种机器学习算法（LASSO回归、支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）和随机森林（RF））的交叉筛选，最终确定DLD、ULK2、CCL8和CCS四个核心DECuAGs。基于这四个基因构建的PD风险预测模型显示出良好的诊断效能，在测试队列中AUC值达0.944，外部脑组织数据集验证AUC值为0.889。
免疫浸润分析显示，PD患者中静息NK细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞和活化树突状细胞比例升高，而浆细胞、静息记忆CD4 T细胞、活化记忆CD4 T细胞和嗜酸性粒细胞比例降低。核心DECuAGs与多种免疫细胞浸润水平显著相关，尤其值得注意的是ULK2表达与M1巨噬细胞丰度呈显著负相关。无监督聚类分析将85例PD患者分为两个亚型，C1亚型以代谢相关通路富集为特征，C2亚型以免疫相关通路富集为特征。
单细胞RNA测序分析揭示了铜死亡活性在PD组显著升高，尤其在星形胶质细胞（ASTs）、多巴胺能神经元（DaNs）和小胶质细胞（MGs）中。四个核心DECuAGs表现出细胞类型特异性表达模式：CCS主要在ASTs中表达，ULK2和CCL8主要在小胶质细胞中表达，DLD主要在DaNs中表达，且这些基因在PD组均显著下调。细胞间通讯分析发现PD组小胶质细胞与其他细胞的相互作用显著减少，尤其是小胶质细胞与星形胶质细胞之间通过NRG信号通路的通讯在PD中显著减弱。在AAV9-A53T α-突触核蛋白小鼠模型中，mIF和蛋白质印迹验证了PD组中多巴胺能神经元DLD水平降低、小胶质细胞ULK2和CCL8表达减少、星形胶质细胞CCS含量降低，同时这些细胞中FDX1表达增加。药理学调节实验显示，铜螯合剂TTM可降低PD小鼠升高的FDX1表达并部分恢复DLD、ULK2、CCS、CCL8和TH水平，而铜离子载体Elesclomol-Cu则进一步加重这些变化。计算机模拟药物筛选和分子动力学模拟确定了四种候选化合物（5,7-二甲氧基黄酮、克雷诺兰尼、曲古抑菌素A和睾酮），分别靶向DLD、ULK2、CCS和CCL8相关蛋白。
**三、关键技术方法**
该研究使用了多项关键技术方法。数据来源于基因表达综合数据库（GEO），包括五个批量mRNA数据集（GSE28894、GSE26927、GSE20186、GSE42966和GSE49126）和一个单细胞RNA测序数据集（GSE243639）。批量转录组数据经批次效应去除后，利用“limma”包进行差异表达基因分析，通过三种机器学习算法（LASSO、SVM-RFE、RF）筛选核心基因。免疫浸润分析采用CIBERSORT反卷积算法。单细胞分析使用“Seurat”包进行降维聚类和细胞类型注释，细胞间通讯分析采用CellChat。动物实验使用AAV9-A53T α-突触核蛋白小鼠模型，通过立体定位注射建立PD模型，结合行为学测试、多重免疫荧光染色、蛋白质印迹和药理学调节实验进行验证。计算机模拟药物筛选采用DSigDB数据库，分子对接使用CB-Dock2在线工具，分子动力学模拟使用YASARA软件。
**四、结果分述**
**1. PD患者脑组织表达谱分析**：通过整合分析三个批量转录组数据集，鉴定出1487个DEGs，其中下调基因793个、上调基因694个。功能富集分析显示这些基因与线粒体能量代谢和氨基酸代谢密切相关，GSEA分析证实PD患者线粒体能量代谢相关通路高度富集。
**2. DECuAGs分析**：通过将DEGs与46个CuAGs取交集获得11个DECuAGs，其中TYR、ULK1和GLS在PD组上调，CCS、SLC25A3、ULK2、CCL8、DLD、DLAT、LIAS和PDHA1下调。功能富集显示这些基因显著富集于“乙酰辅酶A生物合成过程”、“线粒体基质”、“铜离子结合”、“硫辛酸代谢”、“柠檬酸循环”和“丙酮酸代谢”等通路。
**3. 核心DECuAGs筛选与风险模型构建**：通过三种机器学习算法交叉筛选确定DLD、CCL8、CCS和ULK2为hub DECuAGs。基于这四个基因构建的诺模图预测模型具有良好的校准度和临床决策价值，在外部脑组织数据集中验证AUC值达0.889。
**4. Hub DECuAGs特征与PD亚型**：四个核心基因在PD中均显著下调。共识聚类将PD患者分为C1（代谢型）和C2（免疫型）两个亚型，C1富集线粒体膜电位调控和突触可塑性调节等代谢相关通路，C2富集淋巴细胞趋化、自然杀伤细胞趋化等免疫相关通路。
**5. 核心DECuAGs与免疫细胞浸润相关性**：CIBERSORT分析显示PD组M0/M1巨噬细胞、活化树突状细胞比例升高。相关性分析表明ULK2与M0/M1巨噬细胞呈显著负相关，DLD与活化NK细胞正相关，CCS与CD8 T细胞正相关，CCL8与中性粒细胞正相关。
**6. 单细胞分析**：对144977个细胞进行注释，鉴定出八种主要细胞类型，包括DaNs、nDaNs、ASTs、MGs、T细胞、内皮细胞、少突胶质细胞和少突胶质前体细胞。PD组DaNs和nDaNs比例显著减少，MGs、ASTs、T细胞等比例增加。铜死亡活性评分显示PD组ASTs、DaNs和MGs中铜死亡活性显著升高。
**7. 单细胞水平核心基因表达验证**：FDX1在PD组多数细胞类型中上调，而DLD在DaNs中显著降低、ULK2和CCL8在MGs中显著降低、CCS在ASTs中显著降低，与批量转录组数据分析一致。
**8. 细胞特异性计算机模拟扰动分析**：在DaNs中模拟敲除DLD主要影响神经递质转运和突触囊泡组织等神经突触过程；在ASTs中扰动CCS主要影响蛋白质折叠和蛋白稳态；在小胶质细胞中扰动ULK2主要改变炎症和免疫相关信号通路（NF-κB、Toll样受体、TNF和MAPK信号）；扰动CCL8与免疫调节、细胞通讯和突触组织相关。
**9. 细胞间通讯改变**：PD组小胶质细胞与其他细胞间的相互作用显著减少，尤其是小胶质细胞与星形胶质细胞之间的NRG信号通路在PD中显著减弱。在对照组中，小胶质细胞是NRG通路的主要发送者和接收者，但这一特征在PD中消失。
**10. A53T α-突触核蛋白小鼠模型中的表达验证**：mIF和蛋白质印迹分析证实PD组中FDX1荧光强度和蛋白水平显著升高，DLD、ULK2、CCL8和CCS表达显著降低，且呈现细胞类型特异性。
**11. 铜死亡相关分子活性的药理学调节**：TTM处理降低PD小鼠升高的FDX1表达并部分恢复TH和四个核心DECuAG蛋白水平，Elesclomol-Cu处理则进一步增加FDX1表达并加剧这些蛋白的降低，提示这些分子变化对铜死亡相关分子活性的调节具有响应性。
**12. 候选药物的计算机模拟预测**：DSigDB筛选和分子对接确定了四种候选化合物（5,7-二甲氧基黄酮、克雷诺兰尼、曲古抑菌素A和睾酮），分别与DLD、ULK2、CCS和CCL8蛋白具有良好的结合亲和力。120 ns分子动力学模拟显示四个蛋白-配体复合物均具有动态稳定性，MM-PBSA结合自由能计算进一步支持其结合强度。
**五、讨论与结论**
讨论部分总结了本研究的核心发现：DLD、ULK2、CCL8和CCS作为铜死亡相关核心基因，在PD中呈现细胞类型特异性的下调表达，并与代谢功能障碍和免疫异常相关。铜死亡相关分子活性（以FDX1为标志）在PD中升高，与多巴胺能神经元退行性改变相关联，且药理学调节铜死亡相关活性可双向影响FDX1、核心DECuAG蛋白和TH水平，为这些基因与PD的关联提供了支持性药理证据。NRG信号通路在小胶质细胞与星形胶质细胞间通讯的减弱可能构成连接铜死亡相关代谢改变与神经胶质功能障碍的候选分子桥梁。研究还指出了若干局限性：基于公共数据库转录组数据的分析需要更大规模和更多样本人群的验证；单细胞分析来源于单一数据集，样本量相对有限；未进行直接基因特异性功能获得或缺失实验，因果调控关系需进一步确定；CellChat推断的NRG-ERBB4介导的胶质细胞通讯主要基于计算分析，有待实验验证。
研究结论指出，通过整合多组学数据和机器学习方法，本研究系统鉴定了与PD相关的四个铜死亡相关核心基因DLD、ULK2、CCL8和CCS。单细胞转录组学进一步阐明了细胞类型特异性表达和神经胶质细胞参与改变的NRG信号传导。体内验证提供了支持性证据，表明增加的铜死亡相关分子活性伴随这些基因在多巴胺能神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞中的细胞类型特异性下调。此外，细胞类型特异性计算机模拟扰动分析为这些核心DECuAGs的潜在功能相关性提供了产生假说的支持，而TTM和Elesclomol-Cu的药理学调节进一步表明FDX1、核心DECuAG蛋白水平和TH表达对铜死亡相关分子活性调节具有响应性。分子对接和动力学模拟优先筛选出几个靶向这些核心基因相关蛋白的候选化合物以供进一步验证。总体而言，这些发现支持铜死亡相关基因失调与PD中代谢-免疫异常之间的潜在联系，并为进一步实验验证提供了候选生物标志物和治疗线索。
