基于常规F/2与改良F/2-NPK培养基培养的Tetraselmis chuii和Nannochloropsis oculata生化与营养特征分析及其水产饲料应用潜力评估

《Frontiers in Marine Science》：Biochemical and nutritional profiling of Tetraselmis chuii and Nannochloropsis oculata cultivated in conventional F/2 and modified F/2-NPK media for aquafeed applications

　　

海洋微藻因其营养丰富的生物质和可控培养能力，被认为是水产饲料应用中具有前景的可持续原料。然而，对传统营养盐配方的依赖仍是生物质生产的实际制约因素。本研究在常规F/2培养基和改良F/2-NPK培养基中培养Tetraselmis chuii和Nannochloropsis oculata，其中改良F/2-NPK培养基使用商业NPK肥料替代了F/2培养基中的部分大量元素营养源，并评估了其生长、光合色素积累、生化组成及初步投喂性能。两种藻类在两种培养条件下均表现出持续生长。T. chuii在F/2和F/2-NPK培养基中的峰值生物量浓度分别为0.603 ± 0.008 g L^-1和0.570 ± 0.006 g L^-1，N. oculata则分别为0.577 ± 0.008 g L^-1和0.554 ± 0.010 g L^-1，各处理组峰值细胞密度均超过21 × 10⁶ cells mL^-1。光合色素在培养过程中逐渐积累。改良F/2-NPK培养基使N. oculata获得最高碳水化合物含量（37.37 ± 0.31%），并使T. chuii获得最高脂质含量（9.42 ± 0.19%）。T. chuii在F/2和F/2-NPK培养基中的蛋白质含量分别为39.68 ± 0.10%和36.82 ± 0.27%，N. oculata则分别为36.20 ± 0.11%和34.75 ± 0.23%。在初步卤虫（Artemia）投喂试验中，体长逐渐增加，至第20天达到9.12–10.10 mm，表明两种培养条件下产生的生物质在所测条件下均能支持卤虫生长。由于投喂评估以体长为指标，这些发现应视为初步结果，而非对水产饲料功效的全面验证。总体而言，改良F/2-NPK配方在实验室条件下支持了两种微藻的培养，同时保持了有用的生物质和生化特征。进一步的营养表征、商业相关水产养殖物种的受控投喂试验、放大评估及技术经济分析，对于确定所得生物质在水产饲料开发中的更广泛适用性是必要的。

**1 研究背景与目的**

微藻是一类多样化的光合微型生物，在水生生态系统中支撑初级生产力，并参与多种生物地球化学过程，对全球碳固定具有重要贡献。微藻具备生长迅速、光合活性高以及能够积累蛋白质、脂质、碳水化合物、色素、维生素、矿物质和生物活性化合物等特点，因此被视为有前景的工业生物资源。在水产养殖领域，微藻生物质作为可持续且营养均衡的饲料原料受到广泛关注，主要因为其含有高浓度蛋白质和多种营养物质，包括必需氨基酸、多不饱和脂肪酸（PUFAs）、维生素、矿物质和光合色素。此外，某些微藻种类还可改善养殖水生动物的生长性能、免疫应答、抗应激能力和整体健康状况。

在众多海洋微藻中，Tetraselmis属和Nannochloropsis属是研究较为深入的两个类群。Tetraselmis具有较高的生物质产量、良好的环境适应性和积累多种生物活性化合物的能力；Nannochloropsis则以高脂质含量和合成EPA（二十碳五烯酸，一种常见于水产饲料的omega-3脂肪酸）的能力而闻名。尽管这两种微藻的营养和商业价值已被充分认识，但其大规模培养仍面临成本挑战。培养成本的主要制约因素之一是培养基成本，尤其是氮源和磷源等大量元素。传统培养基如F/2和BG-11虽能在高藻密度下维持稳定生长，但对于大规模培养系统而言成本过高。为此，研究人员日益关注可替代的营养盐配方，即在保持生物质生产力的同时降低对常规试剂级营养盐的依赖。其中一种策略是使用商业农业肥料作为培养基的营养源。已有研究表明，肥料型配方能够支持微藻生长，并可能降低培养基相关运营成本。然而，关于NPK营养盐配方如何影响微藻的生物质产量、光合色素积累和生化组成，仍需进一步研究。

基于上述背景，本研究旨在评估改良F/2-NPK配方（以商业NPK肥料替代常规F/2培养基中的大量元素营养源）相对于标准F/2培养基，是否能够支持T. chuii和N. oculata的生长和营养特征。研究人员在两种培养条件下评价了生长性能、生物质产量、光合色素积累、生化组成和营养特征，并对所得微藻生物质进行了初步的卤虫投喂试验，以评估其生物学可接受性和在水产养殖应用中进一步评价的潜力。

**2 主要技术方法**

本研究在阿联酋大学Falaj Hazza实验室开展，每种处理设5个重复。纯种海洋微藻T. chuii和N. oculata购自美国Algae Research Supply公司（Vista, CA, USA）。常规F/2培养基（对照组）和改良F/2-NPK培养基均使用经海盐配制的过滤人工海水；改良培养基以商业水溶性NPK肥料（20:20:20，浓度0.35 g L^-1）替代标准F/2培养基中的NaNO₃和NaH₂PO₄·H₂O，保留F/2微量元素组分，两种配方均不添加维生素混合液。培养条件为盐度25 ppt、pH 8.0、温度24–25 °C，LED冷白光照，光周期18:6 h（光照:黑暗），持续通气，培养周期22天。主要分析方法包括：使用血球计数板测定细胞密度；通过干重法测定生物量；采用分光光度法（UV–Vis spectrophotometer）测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量；按照González López等（2010）、Cheng等（2011）和Van Wychen与Laurens（2013a, 2013b）的方法分别测定蛋白质、脂质和碳水化合物含量；卤虫（Artemia）投喂试验中，卤虫休眠卵在人工海水中孵化后，分别投喂两种微藻活体培养物，投喂量按2 mL（第1–7天）、4 mL（第8–14天）和6 mL（第15–20天）递增，持续20天。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）、Tukey’s HSD多重比较检验及双因素混合设计重复测量方差分析。

**3 主要研究结果**

**3.1 Nannochloropsis oculata在改良F/2-NPK培养基中的光合色素积累**

在改良F/2-NPK培养基中，N. oculata的叶绿素a和类胡萝卜素浓度在培养期间逐渐增加。叶绿素a从接种时的0.402 ± 0.009 mg L^-1增至第20天的最大值1.797 ± 0.006 mg L^-1，约增加4.5倍。类胡萝卜素在第6天首次检出（0.355 ± 0.007 mg L^-1），随后增至第20天的最大值1.165 ± 0.013 mg L^-1。色素积累最显著的时间段为第10至18天，对应培养物的活跃生长期。叶绿素b在整个培养期间均未检出，与Nannochloropsis的特征性色素组成一致。F/2与F/2-NPK培养基的直接比较显示，培养基对叶绿素a积累无显著总体效应（p = 0.359），而类胡萝卜素积累受培养基显著影响（p < 0.0001）。

**3.2 Tetraselmis chuii在改良F/2-NPK培养基中的光合色素积累**

在改良F/2-NPK培养基中，T. chuii的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素浓度均随培养时间逐渐增加。叶绿素a从接种时的0.090 ± 0.012 mg L^-1增至第22天的1.404 ± 0.028 mg L^-1，约增加15.6倍。叶绿素b从第0天的0.267 ± 0.023 mg L^-1增至第18天的最大值1.792 ± 0.026 mg L^-1。类胡萝卜素在第8天首次检出（0.049 ± 0.004 mg L^-1），随后增至第18天的最大值0.538 ± 0.013 mg L^-1。培养基对叶绿素a无显著总体效应（p = 0.224），但叶绿素b（p = 0.0008）和类胡萝卜素（p < 0.0001）均受培养基显著影响。

**3.3 Tetraselmis chuii在常规F/2培养基中的光合色素积累**

在常规F/2培养基中，T. chuii的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素浓度均随培养时间显著增加（p < 0.0001）。叶绿素a从0.091 ± 0.011 mg L^-1增至第22天的1.411 ± 0.028 mg L^-1，约增加15.5倍。叶绿素b从0.283 ± 0.031 mg L^-1增至第16天的最大值1.879 ± 0.043 mg L^-1。类胡萝卜素在第8天首次检出（0.034 ± 0.004 mg L^-1），第18天达到最大值0.523 ± 0.013 mg L^-1。两种培养基的直接比较结果与上述F/2-NPK部分一致。

**3.4 Nannochloropsis oculata在常规F/2培养基中的光合色素积累**

在常规F/2培养基中，N. oculata的叶绿素a和类胡萝卜素浓度均随培养时间显著增加（p < 0.0001）。叶绿素a从第0天的0.506 ± 0.077 mg L^-1增至第18天的最大值1.799 ± 0.007 mg L^-1。类胡萝卜素在第6天首次检出（0.339 ± 0.005 mg L^-1），第18至20天达到约1.148–1.153 mg L^-1。叶绿素b在整个培养期间均未检出。培养基对叶绿素a无显著总体效应（p = 0.359），但类胡萝卜素积累受培养基显著影响（p < 0.0001）。

**3.5 F/2和改良F/2-NPK培养基中的生物量积累与生长性能**

两种微藻的干生物量均受培养时间显著影响（p < 0.0001），生物量持续增加至第18天，随后在培养后期下降。T. chuii在F/2和F/2-NPK培养基中的最大生物量分别为0.603 ± 0.008 g L^-1和0.570 ± 0.006 g L^-1；N. oculata则分别为0.577 ± 0.008 g L^-1和0.554 ± 0.010 g L^-1。统计分析显示，培养基、培养时间及培养基×时间交互作用对两种物种的生物量积累均有显著影响。

**3.6 细胞密度动态**

两种微藻在两种培养基中的细胞密度均随培养时间逐渐增加。第18天记录到最大细胞密度：T. chuii在F/2培养基中为22.86 ± 0.13 × 10⁶ cells mL^-1，N. oculata为22.06 ± 0.59 × 10⁶ cells mL^-1；在F/2-NPK培养基中，T. chuii和N. oculata的最大细胞密度分别为21.44 ± 0.15 × 10⁶和21.44 ± 0.11 × 10⁶ cells mL^-1。第20至22天细胞密度下降，表明培养物进入稳定期和早期衰亡期。

**3.7 投喂微藻生物质的卤虫生长性能**

卤虫体长在所有处理组中均从第5天至第20天逐渐增加。投喂常规F/2培养基培养的T. chuii的卤虫获得最大最终体长（10.10 ± 0.26 mm），其次为投喂F/2培养基培养的N. oculata（9.68 ± 0.19 mm）。投喂F/2-NPK培养基培养的T. chuii和N. oculata的卤虫最终体长分别为9.66 ± 0.21和9.12 ± 0.19 mm。统计分析显示培养基和投喂时间均显著影响卤虫体长。

**3.8 微藻生物质的生化组成**

微藻生物质的生化组成在物种和培养基间存在显著差异（p < 0.05）。总碳水化合物含量以F/2-NPK培养基培养的N. oculata最高（37.37 ± 0.31%），其次为相同培养条件下的T. chuii（36.24 ± 0.23%）。蛋白质含量以常规F/2培养基培养的T. chuii最高（39.68 ± 0.10%），F/2-NPK培养基培养的N. oculata最低（34.75 ± 0.23%）。脂质积累在F/2-NPK培养基培养的T. chuii中最高（9.42 ± 0.19%），其次为同培养基中的N. oculata（8.90 ± 0.20%）。

**4 讨论总结与结论**

讨论部分指出，改良F/2-NPK培养基能够支持两种微藻的生长和生化产物积累，证实商业NPK肥料可作为常规F/2培养基大量元素组分的有效且经济的替代方案。这一发现与Banerjee等（2016）和Ashour与Kamel（2017）的研究结果一致，后者也证明商业农业肥料能够在降低培养基成本的同时产生与标准F/2培养基相当的生长效果。光合色素在活跃生长期（第10–18天）显著积累，反映了微藻光合作用和细胞代谢活性的增强；第18天后色素浓度趋于稳定，可能归因于高培养密度导致的遮光效应和光穿透减少。叶绿素b在N. oculata中始终未检出，与eustigmatophyte微藻的特征色素组成一致。

两种培养基均支持了两种微藻的良好生长，最大生物量出现在第18天，此后的下降趋势可能与营养盐耗尽、自遮效应和代谢副产物积累有关。细胞密度结果进一步证实改良培养基能够支持细胞增殖。卤虫投喂试验表明两种培养条件下产生的生物质均能支持卤虫生长，但由于仅以体长为生长指标，且未设置参考日粮、存活率、干生物量和繁殖力等测量，该结果应视为初步生物学评估。

生化组成分析显示，两种微藻的蛋白质含量为34.75%–39.68%，表明其作为蛋白质丰富饲料原料的潜力。改良F/2-NPK培养促进了碳水化合物积累（N. oculata最高达37.37%），碳水化合物在水产饲料中可作为重要能量来源，并可能通过节约蛋白质分解供能而提高蛋白质利用效率。脂质积累也在F/2-NPK培养条件下得到增强（T. chuii最高为9.42%），但本研究仅测定了总脂质含量，未进行脂肪酸谱表征，因此无法就EPA浓度或脂肪酸富集情况得出结论。

研究结论指出，T. chuii和N. oculata可在常规F/2和改良F/2-NPK培养基中培养。改良F/2-NPK培养基在实验条件下支持了藻类生物质生产和细胞生长，同时促进了碳水化合物和脂质积累。常规F/2培养基中的生物量浓度、光合色素形成和蛋白质含量略高。投喂试验中，卤虫摄食活体微藻培养物未出现不良影响，表明这两种微藻适合作为水产饲料配方的原料。研究还证实了商业NPK肥料可为海洋微藻生长提供主要大量元素。然而，其经济可行性和大规模生产适用性需要通过中试规模培养、详细成本评估和商业相关水产养殖物种的投喂试验加以验证。本研究的局限性包括：仅在受控实验室条件下进行；生化评估仅量化总脂质含量而未确定脂肪酸谱；卤虫投喂试验以体长为唯一主要生长终点，未设置参考/对照日粮、存活率、干生物量或繁殖力参数。未来研究应纳入脂肪酸甲酯（FAME）分析和EPA直接定量，扩展投喂试验至商业相关水产养殖物种，并评估微藻生物质对生长性能、饲料利用、免疫应答、生理健康和产品质量的影响，结合中试规模培养和技术经济评估，以确立T. chuii和N. oculata生物质在未来水产饲料应用中的营养功效、实用适宜性和经济可行性。