《Frontiers in Endocrinology》：Integrative multi-omics analysis unveils the regulatory landscape of diabetic cardiomyopathy: from chromatin accessibility to transcript isoforms and epitranscriptome
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糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是糖尿病患者发生心力衰竭的主要病因，以深刻代谢重塑和舒张功能障碍为特征。然而，与该疾病相关的多层表观转录组和转录后调控网络仍知之甚少。为探究此问题，研究人员建立了高脂饮食（high-fat
糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是糖尿病患者发生心力衰竭的主要病因，以深刻代谢重塑和舒张功能障碍为特征。然而，与该疾病相关的多层表观转录组和转录后调控网络仍知之甚少。为探究此问题，研究人员建立了高脂饮食（high-fat diet, HFD）联合低剂量链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）注射诱导的2型糖尿病相关DCM小鼠模型。通过整合单分子直接RNA测序（direct RNA sequencing, DRS-seq）、染色质可及性分析（ATAC-seq）和常规bulk RNA-seq，研究人员构建了DCM的综合表观遗传-转录调控图谱。利用DRS-seq，研究人员鉴定出21,156条全长转录本，其中8,457条（39.97%）为未注释的新异构体，并观察到糖尿病应激下系统性的3‘-UTR延长。ATAC-seq与DRS-seq联合分析发现四个基因的启动子染色质可及性与转录丰度同步降低，包括Fam210b（线粒体铁稳态）、Cdh22（闰盘黏附）、Fbxo10（泛素介导的RAGE降解）和Cenpx（DNA双链断裂修复），提示染色质可及性改变与DCM转录调控之间存在潜在关联。此外，DRS-seq揭示了心脏表观转录组的广泛改变，在单分子分辨率下鉴定出1,719个差异m?A位点和3,146个差异m?C位点。在这些表观转录组变化中，研究人员观察到m?A与选择性多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation, APA）之间潜在的转录后相互作用。进一步地，通过将CIBERSORT算法应用于DRS-seq数据集，研究人员表征了心脏免疫微环境，揭示以浆细胞和Th1细胞减少以及CD4+记忆T细胞浸润特异性增加为特征的病理重塑。Pearson相关分析显示，在候选基因中，仅下调的线粒体调控因子Fam210b与CD4+记忆T细胞浸润呈显著负相关，提示线粒体功能障碍与局部适应性免疫改变之间存在潜在分子关联。综上，该研究提供了天然心脏转录组和表观转录组的高分辨率图谱，强调表观遗传-转录偶联、m?A-APA协同衰减以及Fam210b相关的局部免疫微环境重塑是潜在的致病因素，从而为糖尿病心力衰竭提供候选治疗靶点。
论文解读
一、研究背景与科学问题
糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是2型糖尿病的隐匿性进行性并发症，临床上表现为心肌肥厚、间质纤维化和早期舒张功能障碍，最终进展为心力衰竭。在慢性高血糖和胰岛素抵抗条件下，心肌发生深刻的代谢底物转换，表现为代谢不灵活性、过度依赖脂肪酸β-氧化、脂毒性、氧化应激和线粒体衰退。尽管表观遗传修饰和转录网络已被广泛证实在这些病理转变中发挥作用，但糖尿病心脏中的转录后调控景观——包括全长转录异构体、选择性多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation, APA）动态变化和表观转录组——仍缺乏系统定义。传统bulk RNA-seq依赖cDNA合成和PCR扩增，固有地引入组成偏差、低估低丰度转录本，并完全抹去天然RNA化学修饰信息，因此无法解析剪接异构体、多位点甲基化和选择性多聚腺苷酸化的完整复杂性。单分子直接RNA测序（direct RNA sequencing, DRS-seq）作为革命性技术，完全绕过逆转录和PCR，保留RNA原始分子特征，可直接读取通过纳米孔的天然RNA，实现全长转录本的无偏鉴定、poly(A)尾长度精确估算以及m?A和m?C等表观转录组修饰的单分子分辨率同步检测。鉴于m?A沉积与APA是高度协调的转录后过程，共同决定mRNA稳定性、定位和翻译，探究二者协同串扰对于解析疾病状态下的转录组衰减至关重要。此外，慢性炎症微环境被认为是DCM心脏重塑的关键驱动因素，但心肌细胞特异性表观遗传和表观转录组衰减事件如何与局部免疫细胞群体通信仍未阐明。
二、研究设计与技术方法
研究人员建立了高脂饮食（high-fat diet, HFD）联合低剂量链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的2型糖尿病相关DCM小鼠模型。7周龄雄性C57BL/6J小鼠先经HFD喂养8周，随后连续5天腹腔注射STZ（35 mg/kg），随机血糖≥16.7 mmol/L者判定为糖尿病并继续HFD喂养8周。对照组给予标准饮食。实验小鼠购自武汉鼠来宝生物科技有限公司。研究整合了三种核心测序技术：DRS-seq用于全长转录本鉴定、m?A/m?C修饰检测和poly(A)尾长度分析；ATAC-seq用于染色质可及性图谱构建；常规bulk RNA-seq用于基因表达定量交叉验证。此外，采用CIBERSORT算法基于DRS-seq表达谱进行免疫细胞浸润反卷积，并通过Pearson相关分析评估候选基因表达与CD4+记忆T细胞浸润的相关性。心脏功能通过超声心动图评估，组织学分析采用Masson三色染色和麦胚凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）荧光标记。
三、主要研究结果
3.1 DRS-seq鉴定DCM全长转录组景观
DRS-seq共鉴定出21,156条全长转录本，其中8,457条（39.97%）为数据库中未注释的新转录本。DCM组平均转录本长度显著长于对照组，提示糖尿病应激下存在异常RNA加工事件。转录本功能分类显示蛋白编码转录本占90.6%，为主要转录本类别。SQANTI3标准流程分类表明，新转录本包括已知基因的新剪接异构体（NIC、NNC等）和完全新基因的转录产物。
3.2 多水平转录组分析揭示异构体特异性调控与代谢重编程
DESeq2分析鉴定出607个差异表达转录本（differentially expressed transcripts, DETs），包括490个注释和117个未注释新转录本。GO富集分析显示两类DETs均显著富集于脂肪酸代谢、脂质代谢和脂肪酸β-氧化等心肌能量代谢通路。基因水平上，DRS-seq鉴定出440个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），bulk RNA-seq仅鉴定出289个，两平台交叉分析获得81个核心DEGs，同样富集于脂肪酸和脂质代谢通路。功能分离分析表明，共享DET/DEG基因主要协调能量代谢，而DET特异性基因富集于蛋白质稳态、细胞内胆固醇平衡和程序性细胞死亡，提示异构体特异性调控可能作为脂毒性应激下维持细胞稳态和蛋白质质量控制（protein quality control, PQC）的转录后缓冲机制。
3.3 ATAC-seq与DRS-seq整合揭示DCM表观遗传-转录偶联
ATAC-seq分析鉴定出71个上调差异可及区域（differentially accessible regions, DARs）和547个下调DARs，下调DARs在启动子区域显著富集。启动子下调DARs相关基因富集于DNA损伤应答、双链断裂修复、细胞衰老、AMPK信号通路和肾素-血管紧张素系统等通路。将DRS-seq鉴定的DETs与启动子DARs整合分析，筛选出15个可能受表观遗传-转录偶联调控的候选转录本，其中四个基因——Fam210b（线粒体铁稳态）、Cdh22（闰盘黏附）、Fbxo10（泛素介导RAGE降解）和Cenpx（DNA双链断裂修复）——表现出转录丰度和启动子染色质可及性的同步显著下调，并经RT-qPCR和bulk RNA-seq交叉验证。
3.4 DRS-seq揭示DCM中m?A和m?C甲基化重编程
DRS-seq分析显示DCM组总m?A位点较对照组略减少，约半数位点呈现高甲基化占有率（>0.5%）。m?A位点在转录本上主要富集于终止密码子附近和3’-UTR区域，NC与DCM组的空间分布模式高度一致。差异甲基化分析鉴定出1,719个差异m?A位点（746个上调，973个下调）。同时，研究还广泛检测到m?C修饰，主要富集于CDS区域和3’-UTR，呈现起始密码子和终止密码子两侧的双峰富集特征。共鉴定出3,146个差异m?C位点（1,633个上调，1,513个下调）。
3.5 m?A与APA协同转录后调控参与DCM发病
APA分析显示DCM组含有≥4个多聚腺苷酸化位点（polyadenylation sites, PAS）的转录本显著减少，共鉴定出335个显著偏移的PAS和320个发生3’-UTR延长或缩短事件的转录本。poly(A)尾长度分析发现约50 bp长度的转录本在DCM中特异性减少。对DETs、差异m?A修饰转录本、差异poly(A)尾长度转录本和APA转录本进行多维重叠分析，鉴定出12个同时发生表达变化、APA位点偏移和m?A修饰重塑的转录本。其中Hmgcs2（酮体生成）、Fbxo21（泛素介导蛋白降解）、Gadd45b（DNA损伤应答）和Lipe（脂肪分解）四个关键基因的上调与m?A修饰减少相关联，提示m?A-APA协同失调可能通过影响转录本稳定性参与DCM心肌基因表达程序改变。
3.6 线粒体Fam210b下调与CD4+记忆T细胞浸润及免疫重塑相关
CIBERSORT反卷积分析显示DCM心脏免疫微环境发生重塑，表现为浆细胞和Th1细胞比例降低，CD4+记忆T细胞浸润信号增加。对八个候选转录本与CD4+记忆T细胞浸润水平进行Pearson相关分析，结果显示仅Fam210b表达与CD4+记忆T细胞浸润比例呈显著负相关（Pearson r = -0.84, p < 0.05），提示Fam210b下调可能桥接心肌线粒体功能障碍与局部适应性免疫重塑。
四、讨论与结论
该研究通过整合DRS-seq、ATAC-seq和bulk RNA-seq，构建了DCM的高分辨率天然转录组和表观转录组图谱。研究揭示了三个潜在的致病机制层面：第一，Fam210b、Cdh22、Fbxo10和Cenpx的表观遗传相关抑制，分别涉及线粒体功能障碍、细胞黏附失败、持续炎症和基因组不稳定；第二，m?A-APA相互作用可能影响Hmgcs2、Fbxo21、Gadd45b和Lipe等代谢调控因子；第三，以CD4+记忆T细胞增加为特征的独特免疫微环境，与Fam210b表达降低相关。既往研究已发现约15.7%的Fam210b纯合敲除小鼠自发产生类似系统性红斑狼疮的自身免疫表型，且Fam210b缺失导致造血细胞活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量，破坏免疫耐受并触发自身免疫。FAM210B还可直接与线粒体外膜转位酶TOM70相互作用，该复合物的完整性对维持线粒体先天免疫反馈具有重要调控作用。
研究结论为：该整合多组学研究提供了DCM中天然转录组、表观转录组和免疫浸润景观的综合图谱，鉴定了多个可能参与DCM病理过程的候选基因和通路，包括Fam210b、Cdh22、Fbxo10和Cenpx的表观遗传相关抑制，Hmgcs2、Fbxo21、Gadd45b和Lipe的m?A-APA相互作用，以及与Fam210b表达降低相关的CD4+记忆T细胞增加的独特免疫微环境。这些分子改变和免疫细胞浸润变化可能代表DCM的相关特征，具有潜在的生物学和转化意义，有待进一步研究验证其功能和治疗价值。
研究局限性包括：动物队列样本量较小（每组n=3），可能限制检测高度动态或低丰度转录变化的统计效力；测序基于bulk心肌组织，可能掩盖心脏成纤维细胞、内皮细胞或浸润免疫群体内的细胞类型特异性异构体异质性和表观转录组动态；未评估舒张功能和更广泛的代谢表型；HFD/STZ小鼠模型与人类2型糖尿病的长期多器官临床复杂性之间存在转化差距。未来需要采用单细胞长读长测序和人类衰竭心脏活检样本验证这些转录后和免疫代谢调控网络。
